Le protéome des faisceaux de poils vestibulaires de souris au cours du développement

Jul 17, 2023

Données scientifiques volume 2, Numéro d'article : 150047 (2015) Citer cet article

7918 Accès

29 Citations

3 Altmétrique

Détails des métriques

Le développement du faisceau de poils des vertébrés est un événement orchestré avec précision qui aboutit à la production d'un arrangement étroitement ordonné de stéréocils riches en actine et d'un seul kinocilium axonémique. Pour comprendre comment la composition protéique du faisceau change au cours du développement, nous avons isolé des faisceaux d'utricules de souris jeunes (jours postnatals P4-P6) et matures (P21-P25) à l'aide de la méthode twist-off, puis caractérisé leurs protéines constitutives à l'aide de la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide avec acquisition dépendante des données. À l'aide de MaxQuant et de la quantification sans étiquette, nous avons mesuré les abondances relatives de protéines dans les deux faisceaux et dans l'ensemble de l'utricule ; la comparaison de l'abondance des protéines entre les deux fractions permet le calcul de l'enrichissement en faisceaux. Ces données, qui sont disponibles via ProteomeXchange avec l'identifiant PXD002167, seront utiles pour examiner les protéines présentes dans les faisceaux vestibulaires des mammifères et comment leurs concentrations changent au cours du développement.

Type(s) de conception

conception de groupes parallèles • conception de répliques • conception de développement d'organismes

Type(s) de mesure

profilage de l'expression des protéines

Type(s) de technologie

dosage par spectrométrie de masse

Type(s) de facteur(s)

Etape du cyle de vie

Caractéristique(s) de l'échantillon

Mus musculus • utricule du labyrinthe membraneux

Fichier de métadonnées accessible par machine décrivant les données rapportées (format ISA-Tab)

Le faisceau de poils des vertébrés, l'organite sensoriel de l'oreille interne, est nécessaire à la mécanotransduction, qui est le processus de conversion des signaux mécaniques comme le son et le mouvement de la tête en excitation électrique dans le système nerveux. Saillant de la surface apicale d'une cellule ciliée sensorielle, le faisceau est composé de dizaines à des centaines de stéréocils remplis d'actine et d'un seul véritable cil axonémique, le kinocilium1. La connaissance de la composition du faisceau est nécessaire pour comprendre comment le faisceau fonctionne et comment il est assemblé. La spectrométrie de masse s'est imposée comme la meilleure méthode à haut débit pour caractériser sa composition protéique. Bien que nous ayons une excellente compréhension du protéome des faisceaux de poils vestibulaires de poussin2, ainsi qu'une vue plus limitée des faisceaux de cochlée de poussin3, la détermination de la composition protéique des faisceaux de poils de souris est une prochaine étape essentielle. Non seulement l'oreille interne de la souris est un modèle exceptionnel pour étudier la surdité humaine et les troubles de l'équilibre, mais les nombreux outils génétiques et moléculaires disponibles pour la souris permettent de nombreuses expériences qui ne peuvent être menées dans d'autres organismes. De plus, on sait relativement peu de choses sur la façon dont la composition protéique du faisceau change au cours du développement ; par exemple, les protéines qui contrôlent les étapes clés de l'allongement des stéréocils ne peuvent être trouvées que dans les jeunes faisceaux.

Les faisceaux de cheveux sont rares; il n'y a que quelques milliers de cellules ciliées dans chaque organe auditif ou vestibulaire, et chez le poulet (et la souris ; voir ci-dessous), les faisceaux représentent moins de 1 % des protéines totales de l'organe2. Seuls ~ 2 ng d'actine sont présents dans les faisceaux d'un utricule de souris4, et l'actine représente> 50% de la protéine totale du faisceau (voir ci-dessous). De plus, bon nombre des molécules les plus intéressantes dans les stéréocils sont présentes à une abondance molaire inférieure à 10−5 celle de l'actine - moins d'une attomole par oreille. Ainsi, les expériences biochimiques pour caractériser le protéome du faisceau nécessitent une dissection approfondie, des méthodes de purification spécialisées et l'utilisation de méthodologies de détection sensibles.

La spectrométrie de masse des protéines est devenue la seule technique avec la sensibilité et la gamme dynamique pour analyser une large gamme de protéines à partir de faisceaux de cheveux. Alors que les méthodes descendantes5 et indépendantes des données6 pour l'analyse des protéines sont susceptibles de se développer suffisamment pour l'analyse des protéines groupées à l'avenir, à l'heure actuelle, la spectrométrie de masse shotgun dépendante des données7 offre une approche bien caractérisée qui permet la détection des protéines à faible et forte abondance, bien qu'en fin de compte limitée par la plage dynamique des spectromètres de masse. De plus, les méthodes de quantification des protéines à l'aide des données de spectrométrie de masse se sont améliorées, permettant une mesure précise de l'abondance relative des protéines à l'aide des intensités des ions parent ou fille8,9. Ensemble, ces techniques permettent une caractérisation approfondie du protéome du faisceau de cheveux.

Nous avons utilisé la technique de purification des faisceaux de cheveux par torsion10, qui capture les faisceaux dans une matrice de gel d'agarose, pour isoler les faisceaux de souris des utricules, l'un des organes vestibulaires (Fig. 1a, b). Quatre répliques biologiques de faisceaux, chacune provenant de 100 oreilles, ont été collectées chez des souris immatures (~ P5) et jeunes adultes (~ P23). Les protéines de faisceau purifiées ont été soumises à une chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) à l'aide d'un spectromètre de masse Orbitrap. Pour fournir une référence pour l'examen de l'enrichissement du faisceau, nous avons également analysé quatre répliques biologiques de 10 utricules de souris à chacun des deux mêmes stades de développement. Nous avons identifié des protéines avec le moteur de recherche Andromeda et les avons quantifiées à l'aide de mesures sans étiquette de l'intensité du peptide précurseur. En comparant l'abondance relative de chaque protéine identifiée dans les faisceaux et l'utricule, nous avons pu déterminer l'enrichissement de la protéine dans les faisceaux de cheveux.

(a) Remplissage de peinture de l'oreille interne de la souris, avec les patchs sensoriels marqués ('utr', utricule ; 'a', ampoules des canaux semi-circulaires ; 'sac', saccule ; 'coch', cochlée). Adapté de la Fig. 1b de la réf. 22 avec autorisation. ( b ) Coloration à la phalloïdine (pour détecter l'actine) d'une région d'environ 50 × 50 μm de l'épithélium utriculaire (environ 100 cellules ciliées, sur environ 3 000). On voit des faisceaux de cheveux sortir de l'épithélium sensoriel utriculaire, qui est marqué par des ceintures circonférentielles d'actine entourant chaque cellule. (c) Flux de travail. Quatre répliques biologiques de chacun des faisceaux P5 (BUN), des faisceaux P23, des utricules P5 (UTR) et des utricules P23 ont été préparées. Parmi les échantillons de faisceaux, ~ 10 % de la protéine dérivée de l'utricule ; les faisceaux représentent <1 % de la protéine dans l'échantillon d'utricule. Les protéines de chacun des seize échantillons ont été séparées à l'aide de courtes séquences SDS-PAGE, et les voies ont été coupées en six morceaux chacune. Les échantillons ont été réduits, alkylés et soumis à une digestion à la trypsine avant LC-MS/MS. Au total, 96 analyses LC-MS/MS ont été réalisées dans le cadre du projet. Les peptides de chaque cycle ont été identifiés à l'aide de MaxQuant ; les données des six tranches de gel par protéine ont été regroupées de sorte que la sortie finale représentait tous les peptides détectés à partir de la seule réplique biologique. MaxQuant a regroupé toutes les protéines qui ne se distinguaient pas par des peptides uniques ; notre regroupement supplémentaire a réuni toutes les protéines qui partageaient au moins 20 % de leurs peptides. ( d ) Faisceaux de poils d'utricule de souris purifiés colorés avec de la phalloïdine pour détecter l'actine (magenta) et du DAPI pour détecter les noyaux (vert). Les faisceaux et les zones de contamination cellulaire substantielle peuvent être vus dans le microscope à dissection, et les régions contaminantes peuvent être coupées des faisceaux. Pour la préparation illustrée, la zone qui serait excisée est indiquée par des lignes pointillées. A noter qu'une certaine contamination nucléaire subsisterait (flèches). ( e ) Immunotransfert de protéines utilisé pour estimer la contamination dans les préparations de faisceaux de souris. Le nombre indiqué d'équivalents d'oreille de faisceaux (à gauche) ou d'épithéliums utriculaires (à droite) a été exécuté. Le panneau supérieur est la tache d'encre de Chine de la tache après le transfert de protéines ; notez les bandes correspondant à l'actine et à la kératine contaminante dans la voie des faisceaux. Les deux panneaux du bas sont des immunotransferts de protéines. Même avec 15 épis de matériel, le marqueur de membrane plasmique Na+/K+-ATPase et la vimentine, protéine de filament intermédiaire, n'ont pas été détectés dans la préparation du faisceau.

Nous avons recueilli quatre ensembles d'échantillons, qui comprenaient des faisceaux de poils de souris purifiés provenant de souris postnatales de 4 à 6 jours (appelées « P5 ») et des utricules P21-P25 (« P23 »), ainsi que des utricules du même âge (tableau 1). Les échantillons groupés sont appelés « BUN » ; ils sont modérément contaminés par des corps cellulaires. Les échantillons d'utricule sont appelés « UTR » ; ils contiennent également des faisceaux de cheveux, bien qu'à <1% de la protéine totale (Fig. 1 supplémentaire). Quatre répliques biologiques ont été préparées pour chacune des quatre conditions. Les protéines ont été partiellement séparées par SDS-PAGE, puis digérées en peptides. La LC-MS/MS a été utilisée pour identifier et quantifier les peptides des quatre conditions. Nous avons utilisé MaxQuant8, avec son moteur de recherche intégré Andromeda11, pour faire correspondre les peptides aux entrées de la base de données de protéines de souris, pour assembler les peptides en protéines et pour quantifier ces protéines. Le flux de travail pour l'isolement du faisceau, la préparation des échantillons, la spectrométrie de masse et l'analyse des données est illustré à la Fig. 1c. Des informations sur les paramètres de l'instrument de spectromètre de masse, la recherche dans la base de données, la cartographie peptide-protéine et la quantification (satisfaisant aux exigences minimales d'information sur une expérience de protéomique [MIAPE]12) sont présentées dans le tableau supplémentaire 1.

Les faisceaux de cheveux ont été purifiés à l'aide de la méthode de torsion2,4,10,13,14 ; les méthodes sont décrites en détail dans la réf. 14. Les macules utriculaires ont été disséquées chez des souris CD-1 à P4-P6 (utricule en développement) ou P21-P25 (jeune adulte). Les méthodes de dissection des utricules de souris ont été présentées ailleurs15,16. Les macules ont été collées au fond non traité d'une boîte en plastique de 35 mm (boîtes de Pétri Falcon EASY GRIP; Becton Dickinson) dans le milieu L-15 de Leibovitz sans rouge de phénol (21083-027; Thermo Life Technologies). Les membranes otolithiques ont été enlevées avec un cil. Une rondelle en plastique a été placée autour des macules sur le plat, et la préparation a été inondée avec 4,5 % d'agarose à bas point de fusion (filtré à travers un filtre de 5 μm) à 42 °C. L'agarose a été laissé durcir en un gel ferme à 4 ° C, puis le disque d'agarose formé par l'anneau a été placé sur une plate-forme de perfusion sous un microscope à dissection. Sous flux constant avec L15, les macules ont été retirées, laissant des touffes de cheveux coincées dans l'agarose. Un petit scalpel ou une aiguille en tungstène a été utilisé pour éliminer les débris cellulaires évidents (Fig. 1b), puis les faisceaux d'un seul utricule ont été retirés dans un bouchon d'agarose de volume minimal (<0, 5 μl). Des faisceaux isolés dans de l'agarose ont été congelés à -80 ° C dans des tubes de microcentrifugeuse à faible liaison aux protéines. Les échantillons de paquets ont ensuite été regroupés pour une analyse par spectrométrie de masse.

Pour l'analyse des macules utriculaires entières, l'utricule a été disséqué pour retirer tous les tissus en dehors de la région de l'épithélium sensoriel et la membrane otolithique a été retirée. Contrairement à nos analyses précédentes des utricules de poussins2,17, où nous avons décollé l'épithélium sensoriel de la membrane basale et du tissu conjonctif, nous avons analysé ici les utricules de souris entières non pelées. L'épithélium sensoriel de l'utricule de souris ne se décolle pas facilement du stroma sans traitement à la protéase (par exemple, collagénase ou thermolysine). En plus des cellules ciliées et des protéines des cellules de soutien, la préparation contenait donc des protéines dérivées de la matrice extracellulaire, du stroma et du nerf.

Pour examiner les faisceaux de cheveux isolés par microscopie à fluorescence, le disque d'agarose contenant les faisceaux de cheveux isolés nettoyés a été lavé dans du milieu L15 dans une plaque à 12 puits. Le disque d'agarose a ensuite été transféré dans du formaldéhyde à 4% dans du PBS et incubé pendant 20 min à température ambiante. Après lavage 2x avec du PBS, les disques ont été stockés à 4°C pendant une nuit. Le lendemain, les faisceaux ont été perméabilisés avec 0, 5% de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min, puis transférés à 13 nM (1: 500 de 6, 6 μM stock) Alexa Fluor 488 Phalloidin (Life Technologies) et 1: 10 000 DAPI (Sigma) dans du PBS pendant 2 à 3 h. Les disques ont été rincés 3x dans du PBS, puis des faisceaux dans de l'agarose ont été retirés du disque dans une fine plaque. Après avoir été placé sur une lame, l'échantillon a été recouvert de milieu de montage VECTASHIELD (Vector Laboratories) et recouvert d'une lamelle.

Pour la caractérisation par immunotransfert, des faisceaux de poils de souris et des utricules ont été prélevés sur des souris P21–25, comme décrit pour les expériences de spectrométrie de masse. Les protéines du faisceau et de l'utricule ont été solubilisées avec un tampon d'échantillon NuPAGE LDS réducteur (Invitrogen); les échantillons ont été chauffés à 65 ° C pendant 15 min, puis à 95 ° C pendant 5 min, et ont été séparés par passage dans un gel NuPAGE 4–12% Bis-Tris (puits 1,5 mm × 10; Invitrogen). Les protéines ont été transférées sur une membrane PVDF (Millipore) en suivant les procédures standard. La membrane a été rincée avec de l'eau et du PBS/0,1 % de Tween-20 (PBST) puis colorée pendant 30 min avec de l'encre noire de Chine (Windsor & Newton) diluée au 1/5 000 dans du PBST. La membrane a ensuite été bloquée pendant 1 h dans le réactif de blocage Amersham ECL prime (GE Healthcare) et incubée pendant une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires de Developmental Studies Hybridoma Bank (anti-vimentine, #AMF-17b; ATPase, anti-Na (+) K (+) sous-unité alpha, # a5) dilué 1: 1 000 dans un réactif de blocage. Après 5 x 6 min de lavages en PBST, la membrane a été incubée 1 h à température ambiante dans des anticorps secondaires (HRP anti-lapin de chèvre et HRP anti-souris de chèvre) dilués au 1/10 000 en réactif de blocage. Les bandes ont été visualisées à l'aide du réactif SuperSignal Pico West ECL (Thermo Scientific).

Pour éliminer les polymères interférents de l'agarose utilisé pour l'isolement du faisceau, nous avons séparé les protéines par une courte course SDS-PAGE avant la réduction, l'alkylation et la digestion à la trypsine2,18. Les protéines de l'utricule ont également été séparées par SDS-PAGE. Pour préparer les échantillons, un tampon d'échantillon NuPAGE LDS 1,2x (Invitrogen) avec du dithiothréitol 50 mM a été ajouté à un volume final combiné de 40 à 60 μl pour 100 utricules de faisceaux; le volume variait d'un échantillon à l'autre en fonction de la quantité d'agarose avec laquelle les faisceaux étaient excisés. Les protéines utriculaires ont également été solubilisées avec un tampon d'échantillon NuPAGE LDS (40 μl pour 10 utricules). Les échantillons ont été chauffés à 65 °C pendant 15 min, puis à 95 °C pendant 5 min. Les protéines ont été séparées en faisant couler environ 1 cm dans un gel NuPAGE 4–12% Bis-Tris (puits 1,5 mm × 10; Invitrogen); une voie a été utilisée pour les échantillons de <50 μl et deux voies ont été utilisées pour les échantillons de > 50 μl. Les gels ont été rincés à l'eau, puis colorés pendant 5 h avec Imperial Protein Stain à température ambiante (Thermo Scientific). Après rinçage à l'eau à 4 ° C pendant 5 h, 1 cm de gel avec des protéines séparées a été tranché manuellement en six morceaux, dont chacun a été traité séparément dans les étapes suivantes.

Les morceaux de gel ont été transférés dans des tubes siliconés, puis ont été lavés avec 200 μl d'eau de qualité HPLC (vortexé 30 s), 200 μl de 50 % 50 mM NH4HCO3/50 % MeOH (vortexé 1 min), 200 μl de 50 % 50 mM NH4HCO3/50 % acétonitrile (vortexé 5 min) et 200 μl d'acétonitrile 100% (vortexé 30 s). La solution restante a été retirée et les morceaux de gel ont été brièvement séchés dans un concentrateur sous vide SpeedVac; ils ont été stockés une nuit à -20 °C.

Les morceaux de gel ont été réhydratés avec 100 ul de DTT 25 mM fraîchement préparé dans NH4HCO3 50 mM, puis ont été incubés pendant 20 min à 56 ° C. Le surnageant a été jeté et 100 ul d'iodoacétamide 55 mM dans NH4HCO3 50 mM ont été ajoutés ; cette solution a été incubée avec les morceaux de gel dans l'obscurité pendant 20 min à température ambiante. Le surnageant a été jeté et les morceaux de gel ont été lavés deux fois avec 400 ul d'eau de qualité HPLC. Les lavages ont été jetés et 200 ul de NH4HCO3 50 % 50 mM/acétonitrile 50 % ont été ajoutés (vortexé 5 min). Ce lavage a été jeté et 200 ul d'acétonitrile à 100 % ont été ajoutés (vortexé 1 min). Le surnageant a été jeté et les échantillons ont été séchés dans le SpeedVac pendant 2 à 3 min.

Nous avons constaté que la digestion dans ProteaseMAX Surfactant-Trypsin Enhancer (Promega) augmentait considérablement la récupération des peptides capillaires. Une solution à 1 % de ProteaseMAX a été préparée en ajoutant 100 μl de NH4HCO3 50 mM à l'aliquote mère en remuant pour mélanger ; cette solution de ProteaseMAX a été conservée sur de la glace. Une aliquote de 1,5 ml de ProteaseMAX à 0,01 % a été préparée en ajoutant 15 µl de ProteaseMAX à 1 % à 1485 µl de NH4HCO3 50 mM. Une aliquote de 1,5 ml de ProteaseMAX à 0,01 %/6 ng de trypsine μl-1 a ​​été préparée en ajoutant 15 μl de ProteaseMAX à 1 % à 1 440 μl de NH4HCO3 50 mM ; la solution a été mélangée, puis 45 μl d'un stock de trypsine de 200 ng μl-1 (grade protéomique Sigma-Aldrich T6567, de pancréas de porc, diméthylé), dilué frais dans du NH4HCO3 50 mM, ont été ajoutés. A chaque morceau de gel, 30 μl de la solution de trypsine 0,01 % ProteaseMAX/6 ng μl-1 ont été ajoutés et incubés pendant 30 min à 4 °C. Les morceaux de gel ont été recouverts de 20 μl de la solution ProteaseMAX à 0,01 % pour les maintenir complètement immergés. On a laissé la digestion à la trypsine se dérouler pendant 3 h à 37 °C.

La solution de digestion a été transférée dans de nouveaux tubes (25 à 40 μl de liquide de chaque tube) et les échantillons ont été combinés si les morceaux de gel d'origine avaient été divisés ; 30 μl d'acide trifluoroacétique à 2, 5% (dans de l'eau de qualité HPLC) ont été ajoutés aux morceaux de gel (vortexés 15 min). La solution a été retirée et combinée avec la solution de digestion initiale. La solution a été vortexée puis la solution combinée a été centrifugée pendant 10 min à 14 000 tr/min dans une microcentrifugeuse. Le surnageant a été transféré dans des tubes filtrants de 0,45 μm (filtres centrifuges Millipore Ultrafree, #UFC0HV00); les échantillons ont été centrifugés pendant 5 min à 4 000 tr/min Tous les échantillons ont été séchés dans le SpeedVac jusqu'à ce que pratiquement toute la solution soit évaporée (~ 2 h), puis ont été stockés à -80 ° C avant la spectrométrie de masse.

La valeur d'une seule expérience de faisceaux de cheveux ou d'utricule a été analysée à l'aide de six cycles LC-MS/MS, correspondant aux six morceaux de gel. Le système LC-MS/MS se composait d'un spectromètre de masse Thermo Electron Orbitrap Velos ETD et d'une source d'ions nanospray Protana, qui était interfacée à une colonne capillaire en phase inversée de 8 cm de longueur × 75 μm de diamètre interne, auto-emballée avec Phenomenex C18 Jupiter de 10 μm de granulométrie. Les échantillons ont été additionnés de 15 µl d'acétonitrile 50 %/acide formique 5 % ; 7,5 µl ont été injectés et les peptides élués de la colonne par un gradient acétonitrile/acide acétique 0,1 M à un débit de 0,5 µl min-1 pendant 1,2 h. La source d'ions nanospray fonctionnait à 2,5 kV. Le condensé a été analysé à l'aide de la capacité dépendante des données de l'instrument, en acquérant dans des balayages séquentiels (1) un seul spectre de masse à balayage complet dans le détecteur Orbitrap à une résolution de 60 000 pour déterminer le peptide m/z et les intensités, et (2) 20 spectres d'ions produits dans le piège à ions, ce qui nous permet de faire correspondre les peptides à la base de données.

Le logiciel MaxQuant version 1.5.1.2 a été utilisé pour l'identification et la quantification des protéines8. Le fichier de contaminants par défaut associé au téléchargement MaxQuant a été modifié pour supprimer les entrées connues pour être présentes dans les faisceaux de cheveux (par exemple, l'actine) et pour ajouter des impuretés supplémentaires qui sont entrées dans le flux de travail de purification du faisceau (par exemple, les kératines, les hémoglobines). Les données de spectrométrie de masse ont été recherchées par rapport à la version Ensembl GRCm38_71 (publiée en avril 2013) à l'aide d'Andromeda11 ; le dossier Ensembl FASTA a été complété par des produits d'épissage alternatifs Xirp2 récemment déterminés19. 'Match between runs' n'a pas été utilisé. Les identifications de protéines ont été signalées avec un taux de fausses découvertes (FDR) de 1 %.

Nous avons utilisé MaxQuant pour calculer l'iBAQ, une mesure de l'abondance des protéines. La valeur iBAQ est obtenue en divisant les intensités protéiques par le nombre de peptides tryptiques théoriquement observables entre 6 et 30 acides aminés20, et est en moyenne fortement corrélée à l'abondance des protéines9,20.

Nous avons écrit un programme Mathematica version 10 pour traiter davantage le fichier MaxQuant 'proteinGroups.txt'. Ce programme (1) a remplacé les noms et symboles de protéines par défaut par des entrées définies par l'utilisateur, (2) a supprimé toutes les entrées marquées par MaxQuant comme un « contaminant potentiel » ou « Inverse » (les protéines étiquetées comme « uniquement identifiées par le site » ont été conservées, (3) ont regroupé les protéines qui partagent > 20 % de leurs peptides, et (4) ont préparé un fichier de sortie.

Le fichier de sortie a été importé dans Excel, où nous avons (5) calculé l'iBAQ relatif (riBAQ)2,9, qui est l'iBAQ pour une protéine ou un groupe de protéines (calculé par MaxQuant) divisé par toutes les valeurs iBAQ non contaminantes et non inversées pour un réplicat, (6) déterminé les moyennes et les écarts-types pour chaque condition expérimentale, (7) les rapports faisceau-utricule déterminés ont été calculés pour chaque âge de développement, et (8) les rapports P5-à-P23 calculés pour les faisceaux et pour les utricules.

Le code Mathematica personnalisé qui prend la sortie MaxQuant et regroupe les protéines associées est disponible dans l'ensemble de données ProteomeXchange (PXD002167).

Tous les fichiers de données et d'analyse, décrits ci-dessous, ont été déposés dans le référentiel ProteomeXchange (numéro d'accès PXD002167 ; http://www.proteomexchange.org). Cet ensemble de données comprend 96 fichiers RAW, représentant les données LC-MS/MS des quatre conditions expérimentales (faisceaux P5, utricule P5, faisceaux P23, utricule P23) représentés par quatre répliques biologiques analysées en six cycles, un pour chaque tranche de gel (Data Citation 1). Le jeu de données comprend également « SEARCH_MAXQUANT.zip », qui contient tous les fichiers MaxQuant du dossier « txt », ainsi que le fichier « experimentalDesignTemplate.txt » qui spécifie comment les fichiers doivent être recherchés par MaxQuant (Data Citation 1). Le fichier FASTA utilisé pour la recherche MaxQuant est inclus en tant que « OTHER_FASTA.zip » (Data Citation 1), et les programmes Mathematica, le fichier d'entrée et les sorties sont regroupés en tant que « OTHER_MATHEMATICA.zip » (Data Citation 1). Enfin, le fichier le plus important pour les lecteurs qui ne souhaitent pas réanalyser les données est « S1 Mouse P4-P21 data Orbitrap-MaxQuant 2015-05-29c.xls », compressé dans l'enregistrement de données sous la forme « OTHER_EXCEL_FINAL.zip » (Data Citation 1) ; c'est le fichier Excel qui contient les données moyennes pour chaque protéine dans chaque condition expérimentale. Ce tableau est reproduit ici en tant que tableau supplémentaire 2.

L'utilité de l'ensemble de données de faisceaux de cheveux dépend de la capacité à ignorer les protéines présentes dans les échantillons de faisceaux résultant d'une contamination par des corps cellulaires ; les dissections sont rarement parfaites. Certains tissus endommagés peuvent être retirés après examen de chaque préparation à l'aide d'un microscope à dissection et d'un éclairage sur fond noir ; nous pouvons alors disséquer la contamination la plus flagrante et la plus évidente (Fig. 1d). Néanmoins, les échantillons de faisceaux isolés ont encore des niveaux significatifs de protéines provenant de structures dont on sait qu'elles ne sont pas présentes dans les faisceaux de cheveux, par exemple, les noyaux et les mitochondries.

Nous évaluons la pureté de la préparation du faisceau de cheveux en déterminant l'abondance relative des histones dans les faisceaux et l'utricule (tableau 2) ; car les protéines nucléaires devraient être absentes des faisceaux. Le rapport BUN/UTR pour les histones représente la fraction de protéine présente dans le BUN qui provenait à l'origine des utricules. En utilisant les entrées d'histone qui ont été détectées dans les analyses 4/4 BUN et 4/4 UTR, nous avons déterminé que l'échantillon P5 BUN était composé d'environ 97 % de faisceaux et que l'échantillon P23 BUN était d'environ 84 % de faisceaux. Les valeurs d'enrichissement pour les deux âges (0,033 ± 0,027 et 0,16 ± 0,10) peuvent être utilisées pour tester statistiquement un enrichissement significatif des protéines dans les faisceaux au-dessus de ces niveaux de fond.

De plus, nous avons également évalué la pureté en effectuant un immunotransfert d'échantillons de faisceaux de cheveux avec des anticorps contre des protéines connues pour être absentes des faisceaux (Fig. 1e). En utilisant des échantillons de P23, les signaux de faisceau pour la Na+/K+-ATPase et la vimentine étaient inférieurs à la limite de détection dans ces tests. Cependant, il s'agissait de préparations distinctes de celles analysées par spectrométrie de masse ; l'analyse des histones des données de spectrométrie de masse P5 et P23 sont plus pertinentes pour évaluer la contamination dans ces préparations.

Quatre répliques biologiques ont été utilisées pour les quatre conditions (P5 BUN et UTR, P23 BUN et UTR). Des diagrammes en boîte montrant la distribution des valeurs de riBAQ pour chacun des 16 échantillons sont illustrés à la Fig. 2a. Un nuage de points matriciel avec des comparaisons par paires de tous les échantillons est illustré à la Fig. 2b. Notez que les échantillons biologiques répétés ont montré les coefficients de corrélation de Pearson les plus élevés (chiffres dans les cases). De même, l'analyse en composantes principales a montré que chacun des quatre ensembles d'échantillons se distinguait clairement les uns des autres (Fig. 2c, d). Plus de 90 % de la variance était due à PC1. Les échantillons de paquets ont montré la plus grande séparation dans PC2 et les échantillons d'utricule dans PC3. Ensemble, les résultats de la Fig. 2 montrent que les répétitions pour chaque condition expérimentale étaient suffisamment similaires pour pouvoir être combinées.

( a ) Boîtes à moustaches montrant les valeurs riBAQ pour toutes les protéines dans les échantillons indiqués. ( b ) Diagramme de dispersion matriciel montrant des comparaisons par paires de protéines détectées dans chacun des deux échantillons. Lignes rouges, lissage LOESS des données. Les nombres sur le côté droit/supérieur de la diagonale sont les valeurs absolues des coefficients de corrélation de Pearson. Notez les corrélations plus élevées pour les répliques biologiques (fond coloré). (c, d) Analyse en composantes principales des 16 échantillons. En (c), PC1 (91 % de variance) est tracé par rapport à PC2 (5 % de variance). En (d), PC2 est tracé en fonction de PC3 (2 % de variance).

Les nombres de protéines identifiées dans les faisceaux et l'épithélium à chaque âge sont indiqués sur la figure 3a. La distribution des valeurs de riBAQ pour les protéines de l'utricule était très similaire à P5 par rapport à P23 (Fig. 3b). La distribution des rapports log P5 / P23 pour chaque protéine était centrée autour de 0, montrant que la majorité des protéines changeaient peu leurs niveaux d'expression entre P5 et P23 (Fig. 3c). Reflétant le plus petit nombre de protéines identifiées, la distribution des protéines de faisceau de protéines riBAQ avait une amplitude réduite et semblait également être un déplacement vers des protéines plus abondantes (Fig. 3d), ce qui était le plus évident lorsque seules les protéines enrichies en faisceaux au niveau 0, 45 ou plus étaient tracées (Fig. 3e). La plupart des protéines détectées dans les faisceaux étaient plus abondantes à P23 qu'à P5 (Fig. 3f). Ensemble, ces données suggèrent qu'un plus petit nombre de protéines abondantes dominaient l'échantillon de faisceau à P5 et qu'au cours du développement, le protéome du faisceau est devenu plus complexe.

( a ) Diagramme de Venn montrant le nombre de protéines ou de groupes de protéines identifiés dans des faisceaux et des échantillons d'utricule. Un petit nombre de protéines n'ont été identifiées qu'en faisceau. ( b ) Distribution du log10 des valeurs moyennes de protéines riBAQ pour les échantillons d'utricule. Seules les protéines détectées à partir de trois échantillons ou plus ont été incluses. ( c ) Distribution des valeurs de riBAQ pour chaque protéine utricule à P5 et P23. Fit est une seule gaussienne (pic à +0,2). ( d ) Distribution du log10 des molécules de protéines moyennes par valeurs de stéréocilium pour les échantillons de faisceaux. Les valeurs de riBAQ ont été converties en molécules par stéréocil en supposant que le riBAQ mesurait avec précision l'abondance fractionnelle des protéines et que l'actine était présente à 400 000 molécules par stéréocil2,9. Seules les protéines détectées à partir de trois échantillons ou plus ont été incluses. (e) Identique à (d), sauf que seules les protéines avec un enrichissement en BUN/UTR de 0,45 ou plus ont été incluses. ( f ) Distribution des valeurs de riBAQ pour chaque protéine de faisceau à P5 et P23. Fit est une seule gaussienne (pic à -0,6). ( g ) Valeurs totales d'iBAQ comme approximation des protéines totales. Les contaminants et les entrées inversées ont été supprimés en premier. Les échantillons d'utricule P5 et P23 étaient similaires, mais il y avait 1,7 fois plus de signal iBAQ dans l'échantillon de faisceau P23 par rapport à P5.

Comme indiqué ci-dessus, alors que des nombres similaires de protéines ont été identifiés dans les utricules P5 et P23, moins de la moitié du nombre de protéines a été identifié dans les faisceaux P5 par rapport aux faisceaux P23 (Fig. 3a). Il y a moins de cellules ciliées utriculaires à P5 qu'à P23 (réf. 21), ce qui se reflète également dans le signal iBAQ total (à l'exclusion des contaminants et des correspondances inversées) ; il y avait presque deux fois plus de signal iBAQ dans les faisceaux à P23 qu'à P5 (Fig. 3g).

Le moteur de recherche Andromeda intégré de MaxQuant doit être utilisé pour faire correspondre les spectres MS2 aux peptides de la base de données, et les protéines seront quantifiées en fonction de leur profil d'intensité MS1. Les paramètres par défaut doivent être utilisés pour l'analyse MaxQuant des fichiers .RAW, à l'exception du fait que l'option de quantification iBAQ doit être cochée.

Nous avons écrit un programme Mathematica (version 10.1.0.0) pour traiter davantage le fichier de sortie MaxQuant 'proteinGroups.txt'. Deux versions du programme sont fournies ; 'MaxQuant 1.2.2.5 souris 2013-12-19.nb' est la version utilisée pour analyser les données dans ce projet, tandis que 'MaxQuant 1.4.1.2 2015-02-25.nb' a été repensé pour les versions plus récentes de MaxQuant et est plus robuste. Ce programme effectue les étapes suivantes :

(1) Remplacer les noms et symboles des protéines. Un fichier utilisateur avec des descriptions de protéines et des symboles associés à chaque identifiant ('Mouse abbrv table 2013-11-21.txt') a été utilisé pour remplacer ceux issus des informations fournies par le fichier FASTA. Pour les symboles protéiques, nous utilisons le nom du gène, tout en majuscules et non en italique, dans tous les cas. Les entrées ambiguës ont été résolues à l'aide de la fonction de recherche orthologue dans Ensembl et avec GeneCards (http://www.genecards.org).

(2) Supprimer les entrées inversées et contaminant. Toutes les entrées marquées par MaxQuant comme « Contaminant potentiel » ou « Inverse » ont été supprimées. Les protéines étiquetées comme « Uniquement identifiées par le site » ont été retenues.

(3) Regrouper les protéines qui partagent > 20 % de leurs peptides. Si un ensemble de peptides pour une protéine était identique ou entièrement contenu dans celui d'une autre protéine, MaxQuant regroupe ces protéines (« groupes redondants ») ; l'entrée avec le plus grand nombre de peptides a été utilisée pour identifier le groupe redondant. Les groupes redondants qui partageaient plus de 20 % de leurs peptides identifiés ont ensuite été regroupés dans notre analyse ("groupes de peptides partagés") ; l'entrée associée à la plus grande intensité a été utilisée pour identifier le groupe de peptides partagés. Ces groupes sont listés dans le fichier nommé '_ 5_GROUPS _LIST.txt'.

(4) Préparez la sortie. Un nouveau fichier ("proteinGroups 2013-12-18c_4_FINAL.txt") a été généré et contient un ensemble d'informations plus limité.

La sortie du fichier Mathematica a été importée dans Excel. Le fichier déposé chez ProteomeXchange contient toutes les formules utilisées pour le traitement encore intactes. Les étapes suivantes ont été réalisées :

(5) Calculez riBAQ. Pour générer une abondance relative pour chaque protéine dans son échantillon, nous avons divisé la valeur iBAQ d'une protéine par la somme de toutes les valeurs iBAQ non contaminantes pour cet échantillon, ce qui donne un iBAQ relatif (riBAQ). Nous avons montré qu'en moyenne, le riBAQ est une mesure précise de l'abondance des protéines9.

(6) Calculer la moyenne et l'écart type pour les répliques biologiques. Nous avons calculé les écarts moyens et standard sur les valeurs riBAQ, et non sur leurs transformations logarithmiques.

(7) Calculer l'enrichissement en BUN/UTR à chaque âge de développement. Ces valeurs d'enrichissement permettent de trier les protéines susceptibles d'être de véritables composants du faisceau de celles qui sont des contaminants.

(8) Calculer l'enrichissement en P5/P23. Ces rapports permettent l'identification des protéines régulées par le développement.

Comment citer cet article : Krey, JF et al. Le protéome des faisceaux de poils vestibulaires de souris au cours du développement. Sci. Données 2:150047 doi : 10.1038/sdata.2015.47 (2015).

Kazmierczak, P. & Muller, U. Son de détection : molécules qui orchestrent la mécanotransduction par les cellules ciliées. Tendances Neurosci. 35, 220-229 (2012).

Article CAS Google Scholar

Shin, JB et al. Architecture moléculaire du faisceau de poils vestibulaires du poussin. Nat Neurosci. 16, 365–374 (2013).

Article CAS Google Scholar

Avenarius, MR et al. Corrélation des niveaux d'expression de l'agent de réticulation et du capsuleur d'actine avec les phases de croissance des stéréocils. Protéomique des cellules Mol. 13, 606–620 (2014).

Article CAS Google Scholar

Dumont, RA, Zhao, YD, Holt, JR, Bahler, M. & Gillespie, PG Myosine-I isozymes dans les épithéliums auditifs et vestibulaires des rongeurs néonatals. J. Assoc. Rés. Otolaryngol. 3, 375–389 (2002).

Article Google Scholar

Ahlf, DR, Thomas, PM & Kelleher, NL Développer une protéomique descendante pour maximiser la couverture du protéome et des séquences à partir des cellules et des tissus. Courant. Opin Chem. Biol. 17, 787–794 (2013).

Article CAS Google Scholar

Gillet, LC et al. Extraction ciblée des données des spectres MS/MS générés par acquisition indépendante des données : un nouveau concept pour une analyse cohérente et précise du protéome. Protéomique des cellules Mol. 11, O111.016717 (2012).

Article Google Scholar

Lu, B., Xu, T., Park, SK & Yates, JR Identification et quantification des protéines Shotgun par spectrométrie de masse. Méthodes Mol. Biol. 564, 261-288 (2009).

Article CAS Google Scholar

Cox, J. & Mann, M. MaxQuant permet des taux d'identification de peptides élevés, des précisions de masse individualisées en ppb et une quantification des protéines à l'échelle du protéome. Nat. Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).

Article CAS Google Scholar

Krey, JF et al. Quantification précise des protéines sans étiquette avec des spectromètres de masse haute et basse résolution. J. Protéome. Rés. 13, 1034-1044 (2014).

Article CAS Google Scholar

Gillespie, PG & Hudspeth, AJ Isolement de haute pureté des faisceaux de poils de ouaouarons et localisation subcellulaire et topologique des protéines constitutives. J. Cell Biol. 112, 625–640 (1991).

Article CAS Google Scholar

Cox, J. et al. Andromeda : un moteur de recherche de peptides intégré à l'environnement MaxQuant. J. Protéome. Rés. 10, 1794-1805 (2011).

Article ADS CAS Google Scholar

Taylor, CF et al. L'information minimale sur une expérience de protéomique (MIAPE). Nat. Biotechnol. 25, 887–893 (2007).

Article CAS Google Scholar

Shin, JB et al. Les faisceaux de cheveux sont spécialisés pour la livraison d'ATP via la créatine kinase. Neurone. 53, 371–386 (2007).

Article CAS Google Scholar

Shin, JB, Pagana, J. & Gillespie, PG Twist-off purification des faisceaux de cheveux. Méthodes Mol. Biol. 493, 241-255 (2009).

Article CAS Google Scholar

Holt, JR, Corey, DP & Eatock, RA Transduction mécanoélectrique et adaptation dans les cellules ciliées de l'utricule de souris, un organe vestibulaire à basse fréquence. J. Neurosci. 17, 8739–8748 (1997).

Article CAS Google Scholar

Cunningham, LL L'utricule de souris adulte en tant que préparation in vitro pour les études sur la mort des cellules ciliées sensorielles induite par des médicaments ototoxiques. Cerveau Res. 1091, 277–281 (2006).

Article CAS Google Scholar

Spinelli, KJ et al. Métabolisme énergétique distinct des épithéliums sensoriels auditifs et vestibulaires révélé par spectrométrie de masse quantitative utilisant l'intensité MS2. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 109, E268–E277 (2012).

Article CAS Google Scholar

Shin, JB et al. La variante R109H de la fascine-2, un agent de réticulation de l'actine régulé par le développement dans les stéréocils des cellules ciliées, sous-tend la perte auditive précoce des souris DBA/2J. J. Neurosci. 30, 9683–9694 (2010).

Article CAS Google Scholar

Francis, SP et al. Une courte forme d'épissage de la répétition de liaison Xin-actine contenant 2 (XIRP2) dépourvue des répétitions Xin est nécessaire pour le maintien de la morphologie des stéréocils et de la fonction auditive. J. Neurosci. 35, 1999-2014 (2015).

Article CAS Google Scholar

Schwanhausser, B. et al. Quantification globale du contrôle de l'expression des gènes chez les mammifères. Nature 473, 337-342 (2011).

Annonces d'article Google Scholar

Burns, JC, On, D., Baker, W., Collado, MS & Corwin, JT Plus de la moitié des cellules ciliées de l'utricule de souris apparaissent pour la première fois après la naissance, un nombre important provenant de la production mitotique postnatale précoce dans les zones de croissance périphériques et striolaires. J. Assoc. Rés. Otolaryngol. 13, 609–627 (2012).

Article Google Scholar

Groves, AK & Fekete, DM Mise en forme du son dans l'espace : la régulation de la structuration de l'oreille interne. Développement 139, 245–257 (2012).

Article CAS Google Scholar

Krey, J., Choi, D. et Barr-Gillespie, P. ProteomeXchange PXD002167 (2015)

Télécharger les références

Ce travail a été soutenu par les subventions NIH R01 DC002368, R01 DC011034 et P30 DC005983 à PGB-G., et F32 DC012455 à JFK Une subvention pilote OCTRI (du prix CTSA UL1 TR000128) a également été utilisée pour le soutien.

Oregon Hearing Research Center & Vollum Institute, Oregon Health & Science University, Portland, 97239, OR, États-Unis

Jocelyn F. Krey et Peter G. Barr-Gillespie

Laboratoire de spectrométrie de masse biomédicale WM Keck, Université de Virginie, Charlottesville, 22908, VA, États-Unis

Nicholas E. Sherman et Erin D Jeffery

Département de santé publique et de médecine préventive, Oregon Health & Science University, Portland, 97239, OR, États-Unis

Dongseok Choi

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

JFK a mené toutes les expériences et édité le manuscrit. NES et EDJ ont réalisé la spectrométrie de masse. DC a effectué une analyse statistique. PGB-G. analysé les données et rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit.

Correspondance à Peter G. Barr-Gillespie.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0 Les métadonnées associées à ce descripteur de données sont disponibles sur http://www.nature.com/sdata/ et sont publiées sous la dérogation CC0 pour maximiser la réutilisation.

Réimpressions et autorisations

Krey, J., Sherman, N., Jeffery, E. et al. Le protéome des faisceaux de poils vestibulaires de souris au cours du développement. Sci Data 2, 150047 (2015). https://doi.org/10.1038/sdata.2015.47

Télécharger la citation

Reçu : 27 mai 2015

Accepté : 13 août 2015

Publié: 15 septembre 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/sdata.2015.47

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

Rapports scientifiques (2021)

Données scientifiques (2018)

Communication Nature (2016)

Rapports scientifiques (2016)

Données scientifiques (2015)