La perte d'activité Mst1/2 favorise la non

Jul 07, 2023

npj Regenerative Medicine volume 7, Article number: 64 (2022) Citer cet article

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Les cellules ciliées sensorielles (HC) des mammifères ont une capacité limitée de régénération, ce qui entraîne une perte auditive permanente après la mort des HC. Ici, nous avons utilisé le séquençage d'ARN in vitro pour montrer que la voie de signalisation Hippo est impliquée dans les processus de dommages et d'auto-réparation de HC. La désactivation de la signalisation Hippo par l'inhibition de Mst1/2 ou la surexpression de Yap induit une accumulation nucléaire de YAP, en particulier dans les cellules de soutien, ce qui induit la production de HC surnuméraire et la régénération de HC après une blessure. Mécaniquement, ces effets de la signalisation Hippo fonctionnent en synergie avec la voie Notch. Il est important de noter que les HC surnuméraires expriment non seulement des marqueurs HC, mais ont également des structures de cils capables de former des connexions neuronales aux régions auditives in vivo. Pris ensemble, la régulation d'Hippo suggère de nouvelles stratégies pour promouvoir la prolifération des cellules de soutien cochléaire, la régénération des HC et la reconnexion avec les neurones chez les mammifères.

Les dommages aux cellules ciliées (HC) provoquent une perte auditive neurosensorielle permanente et affectent des millions de personnes dans le monde entier1,2. Les HC de mammifères adultes endommagés manquent de capacité de régénération3,4, bien que les cellules de soutien (SC) soient une ressource potentielle pour la régénération des HC5,6. Lorsque les HC sont endommagés dans la cochlée néonatale des mammifères, les SC peuvent régénérer les HC soit par régénération mitotique, soit par différenciation trans directe après activation des cellules souches ou des cellules progénitrices, mais cette capacité de régénération est assez limitée7,8,9,10,11. Il est important de noter que la régénération des HC ne se produit pas lorsque l'ablation des HC est induite après une semaine d'âge in vivo12,13. Les interactions et les mécanismes sous-jacents à la régénération nécessitent des recherches plus approfondies, en particulier dans le contexte des paradigmes de dommages cellulaires.

La signalisation hippo est une voie de signalisation hautement conservée qui joue un rôle pléiotrope dans la modulation de la prolifération, de la différenciation, de la survie et de la mort des cellules14. Chez les mammifères, la voie Hippo se compose des sérine/thréonine kinases mammaliennes stériles 20-like kinase 1/2 (MST1/2) et du grand suppresseur de tumeur 1/2 (LATS1/2), tandis que la protéine associée à Yes (YAP) est le principal médiateur en aval de la voie Hippo15,16,17. Lors de la stimulation, MST1/2-SAV1 phosphorylé active le complexe LATS1/2-MOB1a/b, qui à son tour phosphoryle l'effecteur transcriptionnel en aval YAP pour favoriser sa localisation cytoplasmique, appelée Hippo-on18. En l'absence de phosphorylation, YAP est détourné vers le noyau (Hippo-off), où il coopère avec le cofacteur transcriptionnel Tead pour réguler ses gènes cibles impliqués dans la prolifération et la différenciation cellulaire19,20.

Des études antérieures se sont concentrées sur le rôle important de la signalisation Hippo dans la tumorigenèse, car la régulation à la hausse de la signalisation Hippo favorise la croissance cellulaire et inhibe l'apoptose cellulaire dans presque tous les tissus tumoraux21, en particulier sa diaphonie avec d'autres voies de signalisation22,23. Une analyse comparative des puces à ADN a démontré que l'expression génique induite par le déficit en Yap change dans la voie de signalisation Wnt, ce qui peut être associé à la régénération de HC (neuromat) chez le poisson zèbre24. Dans le système auditif, Gnedeva et al. ont rapporté que la perte conditionnelle de Yap était associée à la sortie du cycle cellulaire au stade embryonnaire dans l'organe de Corti et conduisait à des organes sensoriels significativement plus petits25. Les découvertes de Rudolf et al. ont suggéré que les dommages cellulaires surmontent la signalisation inhibitrice d'Hippo et facilitent la prolifération régénérative dans les utricules non mammifères, tandis que la suppression de la signalisation YAP-TEAD dans les utricules de mammifères contribue au maintien de la quiescence proliférative26. Les différentes localisations cellulaires de YAP peuvent expliquer en partie les capacités régénératrices des utricules chez les poussins27. Cependant, la plupart des études sur la voie de signalisation Hippo se sont concentrées sur sa fonction d'inhibition de la prolifération cellulaire et de promotion du retrait du cycle cellulaire dans l'oreille interne, et non sur son application pour favoriser la régénération des HC.

Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la signalisation Hippo dans la cochlée de souris et avons découvert qu'elle est impliquée dans les processus de régénération des HC. Nous avons en outre constaté que l'accumulation nucléaire de YAP est augmentée après une insulte à la néomycine, et que la promotion de YAP pour entrer dans le noyau entraîne une augmentation de la génération de HC surnuméraire chez les souris nouveau-nées. Plus important encore, nos résultats ont démontré que les HC nouvellement générés induits après l'inactivation de Mst1/2 dans les cellules de soutien (SC) Sox9-positives étaient fonctionnels in vivo, ce qui est particulièrement remarquable chez les mammifères.

Les antibiotiques aminoglycosides (tels que la néomycine) sont des toxines connues pour les HC cochléaires, et une perte progressive de HC a été observée dans les cochlées des tours apicaux à basaux après le traitement à la néomycine (Fig. 1a – c, Fig. S1). Pendant ce temps, très peu de SC prolifératifs ont été observés dans de telles situations, et ceux-ci étaient principalement distribués dans les tours apicaux (Fig. 1d). Afin d'explorer le mécanisme moléculaire basé sur la prolifération de SC, une analyse en composantes principales (ACP) des données normalisées d'ARN-seq a été effectuée pour étudier les variances globales entre et au sein des deux groupes. Les cellules traitées à la néomycine et les cellules témoins formaient des grappes distinctes le long de PC1, ce qui expliquait 86 % de la variance. La variance intra-groupe a été révélée par PC2, qui ne représentait que 7 % de la variance. À partir de l'analyse du tracé du volcan et de l'ontologie génétique, nous avons constaté que le complexe ribonucléoprotéique et la biogenèse des ribosomes étaient significativement régulés à la hausse, ce qui était étroitement lié à la prolifération ou à la régénération cellulaire (Fig. S2). L'analyse des voies de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto a montré qu'un grand nombre de voies de signalisation, y compris Hippo et Notch, étaient impliquées dans le processus de mort de HC ou de prolifération de SC (Fig. 1e). Nous nous sommes concentrés sur les modifications de la signalisation Hippo après les dommages HC et avons découvert que 56 gènes de la voie de signalisation Hippo et parmi ses gènes en aval étaient associés aux dommages et processus de réparation HC, notamment Mst1, Lats1 / 2, Mob1b et Amotl2 (Fig. 1f).

a Cochleae de souris néonatales P2 ont été isolées et cultivées pendant 12 h, puis endommagées avec de la néomycine 1 mM pendant 6 h et cultivées pendant 5 jours supplémentaires avec 10 μM d'EdU. b, c Après des dommages à la néomycine, la mort des HC a augmenté de l'apex à la base de la cochlée (Myosin7a + HC, apex : 109,0 ± 6,4 ; milieu : 76,7 ± 6,7 ; base : 43,0 ± 4,6), et l'ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Sidak a montré qu'il y avait une différence significative dans les virages médian et basal. d Très peu de SC prolifératifs ont été observés après les dommages HC (SC doublement positifs Sox2/EdU, apex : 2,4 ± 0,6 ; milieu : 1,4 ± 0,5 ; base : 0,6 ± 0,4), bien que l'ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Sidak ait montré la différence significative dans les virages apical et moyen. e Analyse de la voie de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) des données du transcriptome. f Carte thermique montrant les niveaux d'expression relatifs des gènes exprimés de manière différentielle associés à la voie de signalisation Hippo après des dommages HC. (FDR < 0,01 ; n = 3 pour chaque condition). Les gènes les plus exprimés sont représentés en rouge, tandis que les gènes avec des niveaux relativement inférieurs sont représentés en bleu. g – i Les cochlées de souris P2 ont été disséquées et cultivées pendant 12 h, puis traitées avec de la néomycine 1 mM pendant 6 h. La coloration immunohistochimique a été réalisée après une autre culture de 24 h. Par rapport aux groupes témoins, les résultats de l'analyse quantitative de la coloration immunohistochimique et de la fluorescence relative analysés avec des tests t de Student non appariés à deux queues ont montré que l'accumulation nucléaire YAP (rouge) dans les SC Sox2 + (blanc) était augmentée après une lésion à la néomycine. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Barres d'échelle = 20 μm.

Nous avons en outre observé que l'accumulation nucléaire de YAP dans les SC pouvait être déclenchée par une insulte à la néomycine (Fig. 1g – i). Il a été rapporté que l'accumulation nucléaire de YAP diminue rapidement dans l'organe de Corti, des embryons aux nouveau-nés25, comme le confirment nos résultats (Fig. S3), ce qui suggère que la translocation de YAP du cytoplasme au noyau est associée à la capacité de régénération des cellules cochléaires.

XMU-MP-1, un inhibiteur sélectif de MST1/228, a été utilisé pour désactiver pharmacologiquement la signalisation Hippo dans la cochlée de souris (Fig. 2a). YAP a été augmenté dans le noyau SC (Fig. 2b – h) et l'expression des gènes en aval liés à Hippo a été augmentée de manière dose-dépendante (Fig. 2i). Le rapport de YAP nucléaire a augmenté et le niveau de YAP phosphorylé a diminué dans l'organe de Corti après l'incubation de XMU-MP-1, tandis que le niveau de LATS-1 phosphorylé a diminué (Figs. 2j, k, S4).

a Cochleae de souris néonatales P2 ont été isolées et cultivées. Après 12 h, 1 μM ou 5 μM de XMU-MP-1 ont été ajoutés pendant 24 h. b – g La distribution de YAP (rouge) dans les SC Sox2 + (blanc) du contrôle néonatal P2 et des cochlées de souris traitées par XMU-MP-1 1 μM ou 5 μM, respectivement. Les flèches jaunes indiquent que l'accumulation nucléaire de YAP était très faible dans le groupe témoin, tandis que les flèches blanches indiquent que l'accumulation nucléaire de YAP a été augmentée dans les groupes XMU-MP-1. h La fluorescence relative de YAP dans les noyaux et le cytoplasme des SC dans les groupes témoins et traités par XMU-MP-1 a été analysée avec une ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett, indiquant que XMU-MP-1 favorisait de manière significative la translocation de YAP dans le noyau. i Les niveaux d'expression relatifs de l'ARNm des gènes liés à la voie Hippo et des gènes en aval après un traitement XMU-MP-1 exogène analysés avec une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Tukey. j, k Les Western blots et la quantification relative de la fluorescence de p-YAP, p-LATS, YAP et LATS dans le groupe témoin et les groupes XMU-MP-1 analysés avec une ANOVA à deux voies suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Barres d'échelle = 20 μm.

Nous avons ensuite généré Mst1fl/fl/Mst2fl/fl ; Souris transgéniques Sox9-CreERT2 / + pour désactiver Hippo spécifiquement dans les SC in vivo (Fig. 3a), ce qui a confirmé que l'inactivation conditionnelle de Mst1 / 2 dans les SC entraîne la translocation de YAP dans les noyaux SC (Fig. 3b, c). Le diagramme schématique de la Fig. 3d montre les structures et les sous-types cellulaires de la cochlée. Nous avons confirmé qu'il n'y avait pas de différence significative entre les souris transgéniques Mst1fl/fl/Mst2fl/fl et les souris de type sauvage (WT) sans activation de Cre (Fig. S5). Avec l'injection de tamoxifène dans les groupes témoins WT, aucune cellule EdU + / Sox2 + n'a été observée au jour postnatal (P) 7, ce qui indique que les SC postnatals étaient au repos mitotique après la naissance (Fig. 3e). Cependant, l'injection de tamoxifène a entraîné un nombre important de cellules Sox2 + / EdU + chez les souris knock-out Mst1/2 à la fois dans la région sensorielle (SR) et dans la plus grande crête épithéliale (GER) (Fig. 3e – h). Plus précisément, plusieurs gènes liés à la signalisation Hippo ont été modifiés aux niveaux de la transcription et de la traduction (Figs. S6, S7).

un Mst1f1/f1/Mst2fl/fl ; Des souris Sox9-CreERT2/+ ont été utilisées pour assommer Mst1/2 dans les SC Sox9+ et ainsi désactiver la signalisation Hippo pour favoriser la translocation nucléaire YAP. Le tamoxifène a été injecté à P1–2, et EdU a été injecté à partir de P2–7 et les cochlées ont été récoltées à P7. b Par rapport aux groupes témoins, il y avait beaucoup plus de translocation nucléaire YAP dans Mst1f1/f1/Mst2fl/fl ; Souris Sox9-CreERT2/+. Les noyaux sont entourés de blanc. Par rapport aux témoins, plus de YAP a été transféré dans le noyau cellulaire dans le groupe knock-out Mst1/2. c La fluorescence relative de YAP dans les noyaux et le cytoplasme des SC chez les souris témoins et knock-out Mst1/2 a été analysée avec des tests t de Student à deux queues et non appariés, indiquant que le knock-out Mst1/2 favorisait la translocation de YAP dans le noyau. d Le schéma des vues en coupe de l'orgue de Corti. DC, cellule de Deiters ; PC, cellule pilier ; IPhC, cellule phalangienne interne ; IBC, cellule de bordure intérieure ; GER, grande crête épithéliale. e – h Très peu de SC EdU + ont été détectés chez les souris témoins, et l'ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Sidak a montré qu'il y avait un nombre significativement plus élevé de SC Sox2 + / EdU + dans le SR et le GER avec la quantité totale de SC Sox2 + diminuant dans Mst1f1 / f1 / Mst2fl / fl; Souris Sox9-CreERT2/+. i–m Il y avait un grand nombre de HC nouvellement générés parmi les IHC et les OHC, et de nombreux HC Sox2+/Myosin7a+ ont été détectés à la fois dans les IHC et les OHC de Mst1f1/f1/Mst2fl/fl ; Des souris Sox9-CreERT2/+ (i) et une ANOVA bidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Sidak ont ​​été réalisées pour montrer les différences significatives. n Très peu de HC Myosin7a+/EdU+, environ 0 à 2 par cochlée, ont été observés dans Mst1f1/f1/Mst2fl/fl ; Souris Sox9-CreERT2/+. o Le diagramme schématique de la prolifération de SC chez des souris knock-out Mst1/2 in vivo. p Le diagramme schématique des HC surnuméraires chez les souris knock-out Mst1/2 in vivo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Barres d'échelle = 20 μm.

Myosin7a a été utilisé comme marqueur pour les HC, tandis que Sox2 a été utilisé comme marqueur SC29,30. Dans la couche HC chez les souris P7, il y avait un grand nombre de cellules Myosin7a+/Sox2+ chez les souris transgéniques, mais aucune n'a été observée chez les compagnons de litière témoins. Le nombre total de HC internes (IHC) et de HC externes (OHC) était significativement plus élevé, tandis que le nombre total de cellules Sox2 + dans la couche SC était plus petit chez les souris transgéniques que chez les témoins (Fig. 3i, j, k). Plus intéressant encore, il y avait un nombre significativement plus élevé de cellules Myosin7a + / Sox2 + chez les souris transgéniques, avec une tendance à la baisse de l'apex à la base de la cochlée (Fig. 3l, m). Il a été rapporté que certaines cellules qui sont Myosin7a+ ont également des noyaux Sox2+, ce qui suggère qu'il s'agit de HC nouvellement générés à partir de cellules Sox2+ mais encore à un stade immature30,31. Ainsi, la différenciation directe des SC en HC via la translocation nucléaire YAP a entraîné une augmentation du nombre de HC et une diminution du nombre de SC (Fig. 3f, j, k). De plus, de rares cellules Myosin7a + / EdU + ont été trouvées chez les souris transgéniques, ce qui indique l'existence d'une certaine génération de HC mitotique (Fig. 3n). En conclusion, la différenciation directe et la génération mitotique de HC à partir de SC via la translocation nucléaire YAP se sont produites simultanément chez les souris knock-out conditionnelles Mst1/2, mais la différenciation directe était le mécanisme dominant (Fig. 3o, p).

Sox9 fait partie de la famille Sox des régulateurs transcriptionnels. Il s'exprime principalement dans les CS au stade de développement de l'oreille interne32. Pour identifier l'origine des SC proliférants et des HC surnuméraires induits par la translocation nucléaire YAP, le Mst1fl/fl/Mst2fl/fl ; Sox9-CreERT2/+ ; Des lignées de souris Rosa26-tdTomato/+ ont été créées pour assommer conditionnellement Mst1 et Mst2 dans les SC Sox9-tdTomato+. Les résultats suggèrent que les SC prolifératifs et les HC différenciés proviennent des SC Sox9+. De plus, les cellules Myosin7a + / EdU + peu fréquentes étaient également dérivées de cellules Sox9-tdTomato + et correspondaient à des HC générés par mitose dans les SC Sox9 + tracés par la lignée (Fig. S8). En résumé, la plupart des HC surnuméraires étaient Sox9-tdTomato + / EdU–, illustrant à nouveau que la différenciation directe dominait la génération de HC lors de l'inhibition de la signalisation Hippo et que ces nouveaux HC dérivaient des SC Sox9-tdTomato +.

Identifier les sous-types des HC nouvellement générés dans le Mst1fl/fl/Mst2fl/fl ; Des souris Sox9-CreERT2/+, vGlut3, Prestin et Oncomodulin (OCM) ont été utilisées pour étiqueter les nouveaux HC surnuméraires. Les cellules Myosin7a + de la région OHC exprimaient Prestin, tandis que celles de la région IHC exprimaient vGlut3 (Fig. 4a – f). Une étude précédente a montré que le marquage OCM était principalement confiné aux OHC, avec un certain marquage d'immunoréactivité dans les IHC aux premiers stades de développement33. De manière frappante, nos résultats ont indiqué que presque tous les nouveaux HC étaient OCM + chez les souris transgéniques, tandis que l'immunoréactivité OCM était observée presque exclusivement dans les OHC du groupe témoin avec une très faible expression parmi les rangées IHC à P7. Ce résultat indiquait que les HC nouvellement générés étaient différents des HC d'origine dans une certaine mesure, et peut-être qu'ils étaient plus immatures.

a–f Les HC ectopiques surnuméraires en Mst1fl/fl/Mst2fl/fl ; Des souris Sox9-CreERT2/+ ont été colorées avec le marqueur IHC vGlut3 et le marqueur OHC Prestin. Par rapport aux souris WT, les HC nouvellement générés ont été marqués avec OCM bien qu'ils soient situés dans la région IHC et OHC. g La phalloïdine a été utilisée pour étiqueter la structure des stéréocils et Tuj1 a été utilisée pour étiqueter la fibre nerveuse. Une structure en forme de "V" dans les OHC et une structure en forme de "–" dans les IHC marquées par la phalloïdine ont été observées et entourées de connexions ordonnées de fibres nerveuses marquées par Tuj1 chez des souris témoins P7. h En P7 Mst1fl/fl/Mst2fl/fl ; Les souris Sox9-CreERT2/+, presque toutes les HC, y compris les HC régénérées, avaient des structures en « V » et « – » de forme similaire marquées par la phalloïdine dans les OHC et les IHC, respectivement. Le marquage Tuj1 a montré 1 à 2 rangées de HC internes et 3 à 5 rangées de HC externes entourées de fibres nerveuses irrégulières. i, j Les vues en coupe de la phalloïdine et de la coloration Tuj1 chez les souris témoins et transgéniques à P7. k – m La vue représentative des structures ciliaires du tour apical à basal de l'organe de Corti chez les souris WT sous un microscope électronique. n–p Chez un compagnon de portée P7 Mst1fl/fl/Mst2fl/fl ; Chez les souris Sox9-CreERT2/+, des faisceaux de poils immatures ont été détectés avec une diminution du tour apical au tour basal. Les vues agrandies des faisceaux IHC et OHC in situ chez les souris knock-out et Mst1/2 et les faisceaux de cheveux ectopiques immatures avec des microvillosités légèrement plus longues et un kinocilium du tour apical à basal sont présentés à droite. q Mst1fl/fl/Mst2fl/fl ; Sox9-CreERT2/+ ; Des souris Rosa26-tdTomato/+ ont été utilisées pour mener l'expérience de patch-clamp. Après l'injection de tamoxifène à P1-2, les cochlées ont été récoltées à P7, ainsi les HC Sox9-tdTomato+ ont pu être observés au microscope. r Courants K+ sortants représentatifs des OHC WT P7 évoqués par les échelons de tension indiqués ci-dessus. s Courants K+ sortants représentatifs de HC régénérés chez des souris transgéniques évoqués par les mêmes étapes de tension indiquées ci-dessus. t Moyenne ± SEM IK (courant potassique redresseur retardé) en réponse à une dépolarisation de 0 mV des OHC WT P7 (n = 10) et des HC régénérés (n = 19). u Relation courant-tension de crête moyenne ± SEM des OHC WT P7 et des HC régénérés. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Barres d'échelle = 20 μm dans (a – f, g, h). Barres d'échelle = 5 μm à faible grossissement et 2 μm à fort grossissement, respectivement en (k – p).

Tuj1 a été utilisé pour étiqueter les projections neuronales auditives entourées de cellules de type HC régénérées in vivo. Une rangée d'IHC et trois rangées d'OHC étaient entourées de connexions de fibres nerveuses chez les souris témoins. En revanche, il y avait 1 ou 2 rangées d'IHC et 3 à 5 rangées d'OHC chez les souris transgéniques, et les neurites autour de chaque HC se sont développés vers le SR, comme on le voit dans les sections coronales et axiales (Fig. 4g – j). Les stéréocils des HC cochléaires étaient disposés comme une structure en forme de "V" reconnaissable dans les OHC et une structure en forme de "–" dans les IHC dans les deux groupes, tandis que les cils des HC régénérés étaient légèrement désorganisés et désalignés chez les souris transgéniques. La microscopie électronique à balayage a été utilisée pour visualiser davantage les cils des HC nouvellement régénérés, et nous avons trouvé des faisceaux de cheveux immatures dans les nouveaux HC à P7 (Fig. 4k – p). Ces résultats fournissent des preuves de l'état des HC nouvellement générés in vivo, qui ont des structures ciliaires similaires mais immatures par rapport aux souris WT. De plus, la fluorescence verte du colorant FM1-43FX a été co-marquée avec tdTomato après l'inactivation de MST1/2 dans les SC Sox9 +, ce qui indiquait que les nouveaux HC avaient des canaux de transduction fonctionnels (Fig. S8i).

Une expérience de patch-clamp sur cellules entières a été réalisée dans ces HC surnuméraires. Des courants de K + sortants soutenus ont été enregistrés dans les HC nouvellement générés, similaires aux HC au cours du développement dans l'organe de Corti. Ces résultats ont indiqué que les HC régénérés in vivo possèdent certains canaux de transduction et une fonctionnalité électrophysiologique (Fig. 4q – u).

L'effet de XMU-MP-1 dans les cochlées endommagées par la néomycine in vitro est illustré sur la figure 5a. Nous avons constaté que beaucoup plus de cellules Myosin7a + / Sox9-tdTomato + étaient générées avec le traitement XMU-MP-1 par rapport aux cochlées témoins (Fig. 5b, c). Numériquement, davantage de cellules Sox9-tdTomato+/Myosin7a+ ont été trouvées dans le groupe traité par XMU-MP-1, avec un schéma décroissant de l'apex à la base (Fig. 5d), indiquant ainsi qu'un grand nombre de SC Sox9+ s'étaient directement différenciés en HC en réponse à XMU-MP-1.

un Sox9-CreERT2/+ ; Rosa26R-tdTomato/+ et Atoh1-CreEsr1/+ ; Des modèles de souris Rosa26R-tdTomato/+ ont été utilisés pour retracer les lignées SC et HC. Le tamoxifène a été injecté à P1 pour activer l'expression de tdTomato pendant la nuit, et les cochlées ont été récoltées à P2 puis cultivées in vitro. Après une exposition à la néomycine pendant 6 h, les explants cochléaires ont été cultivés avec du XMU-MP-1 exogène ou du DMSO à 0,5 % pendant 5 jours. b – d Par rapport aux témoins, le nombre de HC Myosin7a + / Sox9-tdTomato + a été largement augmenté du tour apical au tour basal dans le groupe traité par XMU-MP-1 analysé avec une ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Sidak. e–g Il y avait un grand nombre de Myosin7a+/Atoh1-tdTomato– HC dans les groupes traités par XMU-MP-1 par rapport aux témoins analysés avec une ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Sidak. h Le diagramme schématique des HC Myosin7a+/Sox9-tdTomato+ après traitement XMU-MP-1. i Le diagramme schématique des HC Myosin7a+/Atoh1-tdTomato– après traitement par XMU-MP-1. j, k Les explants cochléaires de souris P2 WT ont été récoltés puis mis en culture. Après une exposition à la néomycine pendant 6 h, les explants ont été cultivés avec du XMU-MP-1 exogène ou du DMSO à 0,5 % pendant 24 h. Les résultats de la coloration immunohistochimique ont montré que l'ajout de XMU-MP-1 augmentait de manière significative l'accumulation nucléaire de YAP1 dans les SC Sox2 + après une lésion à la néomycine. l, m Après une lésion à la néomycine, les cochlées ont été cultivées avec du DMSO ou du XMU-MP-1 pendant 5 jours supplémentaires, et 10 μM d'EdU ont été ajoutés tout le temps pour suivre les cellules proliférantes. Dans le groupe témoin avec traitement au DMSO, aucun HC proliférant et très peu de SC ont été détectés. Dans le groupe traité par XMU-MP-1, il y avait des SC et des HC EdU + du virage apical au virage basal. n Les HC EdU + étaient principalement répartis dans le tunnel entre les HC internes et externes, et ils apparaissaient principalement par paires et colorés avec Sox2. o–q Par rapport aux groupes témoins, il y a eu une augmentation significative du nombre de SC et de HC en prolifération après l'ajout de XMU-MP-1 analysé in vitro avec une ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Sidak. Le nombre total de HC a été considérablement augmenté. r–t Environ 16 % seulement des HC étaient EdU+ par rapport à la proportion accrue de HC dans le virage apical ; sHC : HC surnuméraire. u Le diagramme schématique des HC régénérés par mitose et des SC en prolifération. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Barres d'échelle = 20 μm.

Atoh1, qui fait partie de la famille de transcription bHLH, est nécessaire et suffisant pour le développement précoce de la HC de l'oreille interne34. Dans Atoh1-CreEsr1/+ ; Chez les souris Rosa26R-tdTomato/+, nous avons constaté que dans le groupe témoin, la plupart des HC étaient Atoh1-tdTomato+, tandis que chez les souris transgéniques, les cellules Myosin7a+/Atoh1-tdTomato– se trouvaient dans le tunnel entre les IHC et les OHC (Fig. 5e – g). Ces résultats ont indiqué que XMU-MP-1 augmentait significativement la différenciation des HC après une insulte à la néomycine, et que les HC régénérés étaient principalement différenciés des progéniteurs Sox9 + plutôt que des HC Atoh1-tdTomato + (Fig. 5h, i). La distribution des cellules Sox9-tdTomato + et des cellules Atoh1-tdTomato + dans la couche HC sans dommages à la néomycine a été illustrée à la Fig. S9a, b.

Chez les souris WT, l'ajout de XMU-MP-1 a augmenté de manière significative l'accumulation nucléaire de YAP1 dans les SC Sox2 + après une lésion à la néomycine (Fig. 5j, k) et aucune cellule Myosin7a + / EdU +, mais quelques cellules Sox2 + / EdU + ont été trouvées dans le groupe témoin néomycine. À l'inverse, un nombre significativement accru de cellules Sox2 + / EdU + et Myosin7a + / EdU + a été trouvé dans les cochlées traitées par XMU-MP-1 (Fig. 5l – q). Fait intéressant, presque toutes les cellules Myosin7a+/Sox2+/EdU+ étaient présentes ensemble par paires. De plus, nous avons constaté que la plupart des HC proliférant de manière mitotique étaient situés entre les IHC et les OHC, qui est la région où les cellules précurseurs sont enrichies7 (Fig. 5n). Ces résultats suggèrent que la régulation de la signalisation Hippo pourrait être un régulateur de prolifération SC dépendant du contexte qui induit une prolifération SC significativement plus importante dans le cas de cochlées endommagées. De plus, les HC générés par la mitose (EdU + / Myosin7a + / Sox2 +) étaient clairement augmentés par rapport aux cochlées intactes (Fig. S9c, d), mais ils n'étaient toujours pas le principal type de cellule résultant de la régénération des HC induite par la translocation nucléaire YAP in vitro (Fig. 5q – u).

Comme les résultats ci-dessus l'ont indiqué, la protéine YAP a augmenté dans le noyau SC après des dommages à la néomycine (Fig. 1g – i). De plus, XMU-MP-1 a favorisé la translocation nucléaire de YAP dans les SC de manière dose-dépendante, non seulement dans l'état intact (Fig. 2b – g), mais également dans l'état de dommages à la néomycine (Fig. 5j, k), ce qui a fourni une preuve supplémentaire solide que la translocation nucléaire de YAP est associée à la régénération de HC.

Nous avons ensuite essayé de déterminer si la désactivation d'Hippo initiait la génération de HC surnuméraires par stimulation de la translocation nucléaire YAP. L'adénovirus a été utilisé comme vecteur pour une transfection efficace des explants cochléaires, et l'adénovirus recombinant (Ad-YAP et Ad-YAP-GFP) a été généré pour surexprimer Yap1. La concentration optimale de 3 × 109 PFU / ml d'adénovirus a été sélectionnée pour une analyse plus approfondie (Fig. 6a – g). Un nombre significativement accru de cellules Myosin7a + et de cellules Myosin7a + / EdU + a été trouvé dans les cochlées traitées par Ad-YAP (Fig. 6h – k). Ces résultats suggèrent que la différenciation directe domine la régénération des HC par rapport aux HC générés par mitose.

a Après exposition à la néomycine pendant 6 h, les explants cochléaires ont été cultivés avec Ad-GFP / Ad-Yap-GFP exogène pendant 48 h, et l'efficacité de transfection basée sur la fluorescence GFP a été analysée dans les SC Sox2 + dans le SR. b, c Les cellules GFP + / Sox2 + ont été comptées et les résultats ont montré que l'efficacité de la transfection augmentait avec l'augmentation des concentrations d'adénovirus (107, 108, 109, 3 × 109 et 1010 PFU / ml). d Le nombre de SC Sox2+ traités avec différentes concentrations d'adénovirus a été calculé. Il a été constaté que le nombre de SC diminuait légèrement à forte concentration. e, f Pour réguler positivement l'expression de Yap, les explants cochléaires après insulte à la néomycine pendant 6 h ont été traités avec Ad-Yap-GFP pendant 48 h. Un test t à un échantillon a été effectué et a montré que YAP était significativement augmenté avec une concentration de 3 × 109 PFU/ml d'adénovirus, et la distribution de YAP dans le noyau était significativement augmentée. g Le niveau d'expression relatif de l'ARNm de la signalisation Hippo et des gènes cibles en aval après le traitement Ad-Yap-GFP, et une ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Sidak ont ​​été effectuées pour montrer les différences significatives. h – k Après une exposition à la néomycine pendant 6 h, les explants cochléaires ont été cultivés avec Ad-mus-Yap1 ou Ad-null pendant 7 jours, et 10 μM d'EdU ont été ajoutés tout le temps pour tracer les cellules proliférantes. Dans le groupe témoin avec traitement Ad-null, aucun HC ou SC en prolifération n'a été détecté. Dans le groupe de traitement Ad-mus-Yap1, il y avait significativement plus de SC et de HC EdU + du virage apical au virage basal analysés avec une ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Sidak. Par rapport aux témoins, le nombre de HC a été significativement augmenté du tour apical au tour basal analysé avec une ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Sidak. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Barres d'échelle = 20 μm en (b) et (h), Barres d'échelle = 10 μm en (e).

Dans notre étude précédente, nous avons constaté qu'une régulation coordonnée de l'activation de Wnt et de l'inhibition de Notch pouvait favoriser la régénération de HC dans la cochlée de souris postnatale7,35. En analysant les transcrits des cochlées après une lésion à la néomycine, l'analyse du réseau d'interaction protéique à l'aide de STRING a indiqué que l'expression des gènes liés aux voies de signalisation Hippo, Notch et Wnt variait de manière remarquable dans le processus de régénération (Fig. 7a). Les résultats de la RT-qPCR ont indiqué que l'inhibition d'Hippo s'accompagnait d'une régulation à la hausse des gènes liés à la transformation de HC (Atoh1, Brn3.1), à la voie de signalisation Notch (Jag1, Hes1 et Hes5) et à Yap/Taz et ses gènes effecteurs en aval (ACTG et Amotl2) dans les cochlées traitées par XMU-MP-1 après une insulte à la néomycine (Fig. 7b).

une analyse du réseau d'interaction protéine-protéine des gènes exprimés de manière différentielle des voies de signalisation Hippo, Notch et Wnt. Les lignes violettes indiquent les interactions entre les gènes Hippo et Wnt, et les lignes orange indiquent les interactions entre les gènes Hippo et Notch. La couleur des nœuds indique le changement de pli de l'expression du gène. b Les explants cochléaires de souris P2 de type sauvage ont été récoltés puis cultivés. Après exposition à la néomycine pendant 6 h, les explants ont été cultivés avec XMU-MP-1 ou DMSO pendant 24 h. Les niveaux d'expression d'ARNm apparentés entre les groupes traités par XMU-MP-1 et les témoins sont indiqués, et une ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Sidak a été effectuée pour montrer les différences significatives. c Les explants cochléaires de souris P2 WT ont été récoltés puis cultivés. Après exposition à la néomycine pendant 6 h, les explants ont été cultivés avec des composés exogènes (y compris XMU-MP-1, BIO ou DAPT) ou 0, 5% de DMSO pendant 3 jours, et 10 μM d'EdU ont été ajoutés tout le temps pour tracer les cellules proliférantes. d–g Le nombre total de HC et de HC EdU+ n'était pas significativement différent entre les groupes traités par XMU-MP-1 et XMU-MP-1/BIO. e, h, i Le nombre de HC régénérés a été significativement augmenté dans le groupe traité par XMU-MP-1/DAPT par rapport au groupe traité par XMU-MP-1. j Une ANOVA bidirectionnelle suivie d'un test de comparaisons multiples de Dunnett a été réalisée et a montré que la régulation à la hausse de la signalisation Wnt par BIO pouvait favoriser la prolifération des SC. Cependant, la co-régulation XMU-MP-1 / DAPT a généré plus de HC, y compris les HC EdU +, et un grand nombre de SC proliférants ont été trouvés dans le GER. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Barres d'échelle = 20 μm.

De plus, nous avons étudié les effets synergiques/antagonistes de la désactivation d'Hippo avec d'autres signaux (Fig. 7c). Certains SC proliférants et HC régénérés dans le SR ont été observés lorsque la signalisation Hippo était désactivée seule (Fig. 7d, e, j), tandis qu'un grand nombre de SC proliférants (dans le SR et le GER) et presque aucun HC différencié directement n'ont été observés lorsque la voie Wnt était activée seule (avec BIO) (Fig. 7f, j). Nous avons observé des SC en prolifération et des HC régénérés dans le SR lorsque la désactivation d'Hippo était combinée à l'activation de Wnt (Fig. 7g, j). La prolifération des SC dans le groupe combiné inactivation/activation Wnt de Hippo était significativement inhibée par rapport à l'activation de la voie Wnt seule, mais ressemblait à celle de la régulation de la voie de signalisation Hippo seule, en particulier dans le SR. Pendant ce temps, les HC directement différenciés n'étaient pas affectés par l'activation de Wnt, et leurs nombres étaient similaires à ceux observés lors de la désactivation de la signalisation Hippo seule. Ces résultats indiquent qu'il n'y a pas d'effet synergique évident de l'activation de Wnt et de l'inactivation d'Hippo.

Enfin, certains SC proliférants et un grand nombre de HC directement différenciés ont été observés dans le SR lorsque la voie Notch était inhibée seule (Fig. 7h, j), et de nombreux SC proliférants et HC régénérés ont été observés lorsque la régulation à la hausse d'Hippo était combinée à la suppression de Notch (avec DAPT) (Fig. 7I, j). Plus précisément, la prolifération des SC a été significativement réduite dans le SR par rapport à celle observée avec l'inhibition de Notch seule, mais la prolifération des SC a été principalement trouvée dans le GER. En outre, le nombre de HC directement différenciés a augmenté de manière significative par rapport à la désactivation d'Hippo seul. Ces résultats suggèrent qu'il y avait un effet synergique significatif de la signalisation Notch sur la voie Hippo, en particulier dans la promotion de la différenciation directe des SC en HC. En conclusion, la régulation Hippo/Wnt/Notch, en particulier la combinaison de Hippo et Notch, semble jouer un rôle important dans la régénération des HC de l'oreille interne.

La signalisation Hippo-YAP est un régulateur important de l'homéostasie tissulaire, de la taille des organes et des cellules souches36. Notre précédente analyse de séquençage d'ARN entre les progéniteurs Lgr5 + traités à la néomycine et intacts a révélé que Bmpr2, Wnt7a et Fzd7 étaient régulés positivement, tandis que Id1, Id2 et Id3 étaient régulés négativement parmi les gènes de la voie Hippo37. Dans la présente étude, nous nous sommes concentrés sur la signalisation Hippo, et 56 gènes liés à Hippo se sont avérés associés aux dommages HC et aux processus d'auto-réparation. Nos résultats ont indiqué que les processus biologiques de dommages et de réparation existaient simultanément dans les cochlées endommagées.

En tant que régulateur dépendant du contexte, la signalisation Hippo est impliquée dans la prolifération cellulaire, la différenciation et l'apoptose dans divers sous-types cellulaires38. YAP, en tant que molécule effectrice de la voie Hippo, est requise pour certaines spécifications cellulaires au cours des toutes premières phases du développement embryonnaire20,39. Gnedeva et al. ont caractérisé le rôle de YAP dans le maintien de l'état prolifératif de l'organe des progéniteurs Corti avant l'établissement du domaine prosensoriel postmitotique25. En réponse aux dommages, la signalisation indépendante d'Hippo peut favoriser l'effet de YAP pour prévenir la transformation maligne40. Ici, nous avons montré le modèle intracellulaire de YAP chez les souris néonatales (P2), avec YAP principalement distribué dans le cytoplasme et seulement des signaux faibles dans le noyau cellulaire. La translocation cytoplasmique-nucléaire YAP a été initiée par la néomycine. Ces résultats suggèrent que l'accumulation nucléaire de YAP pourrait jouer un rôle important dans le processus d'endommagement et d'auto-réparation des HC et que la régulation de l'accumulation nucléaire de YAP pourrait être cruciale pour la régénération des HC après un dommage.

La signalisation hippopotame joue un rôle important dans le maintien de l'homéostasie et le maintien de la taille des organes grâce à des boucles de rétroaction biochimiques19,41. Il a été largement rapporté que la signalisation Hippo régule la taille des organes et atteint des niveaux homéostatiques en modulant la prolifération, la survie et la différenciation dans le tissu hépatique des mammifères42,43,44,45. Une étude récente a mis en évidence le rôle du complexe facteur de transcription Yap/Tead, qui est la molécule effectrice de la voie Hippo, dans le maintien des cellules progénitrices de l'oreille interne au cours du développement25,26. D'autres études ont indiqué que l'activation de YAP dans les cardiomyocytes postnatals peut stimuler l'expansion des cardiomyocytes dans la régénération thérapeutique du myocarde46,47. Ici, nous avons rapporté le rôle de l'expression et de la localisation de Yap après des dommages HC dans les cellules cochléaires de mammifères néonatals. Les gènes en aval de la voie Hippo ont été régulés positivement par XMU-MP-1, ce qui pourrait être étroitement lié au processus de reprogrammation SC et de régénération HC.

Il a été rapporté que la perte de kinases en amont ou l'activation de YAP peut réguler les décisions de croissance et de destin cellulaire dans les cellules progénitrices39,48. Pour étudier l'effet de la voie de signalisation Hippo dans l'oreille interne, nous avons inhibé pharmacologiquement la voie de signalisation Hippo induisant ainsi la translocation nucléaire YAP in vitro, et nous avons en outre utilisé des souris knock-out conditionnelles Mst1/2 pour vérifier le rôle de l'inhibition d'Hippo dans l'oreille interne in vivo. Nous avons observé un certain nombre de SC en prolifération, ce qui était cohérent avec leurs fonctions connues de régulation de la croissance et du développement d'autres organes20. Plus important encore, la génération proliférative et la différenciation directe des HC des SC ont été observées chez des souris transgéniques in vivo, et la translocation nucléaire de YAP pourrait reconstituer les HC endommagés par la néomycine in vitro. Plus précisément, plus de 80 % des HC augmentés étaient non prolifératifs, illustrant que la différenciation directe était le processus dominant de génération de HC en réponse à l'inhibition d'Hippo et que cela pourrait être étroitement corrélé à la prolifération limitée des SC. De plus, nous avons utilisé le Mst1fl/fl/Mst2fl/fl ; Sox9-CreERT2/+ ; Lignée de souris Rose26-tdTomato/+ pour montrer que presque tous les HC surnuméraires provenaient de SC Sox9+. Ces résultats ont montré que l'inhibition d'Hippo pouvait favoriser la prolifération des SC et induire la génération de HC surnuméraires en maintenant l'équilibre dynamique entre les différents sous-types cellulaires de l'oreille interne. De plus, nos résultats ont démontré que la translocation nucléaire de YAP pourrait initier une génération plus mitotique et une différenciation directe en HC pour reconstituer les HC endommagés par la néomycine, ce qui pourrait être un mécanisme de rétroaction régulé par la signalisation Hippo. La régénération des HC a entraîné une réduction du nombre de SC et a donc induit une prolifération des SC, qui à son tour a conduit à une nouvelle génération de HC49. Ces processus pourraient ne pas exister indépendamment mais pourraient plutôt s'influencer mutuellement par un équilibre dynamique au sein d'une boucle fermée.

Il est à noter que les dommages à la néomycine associés à l'inactivation des kinases MST1/2 par XMU-MP-1 induit de manière dose-dépendante l'acquisition sensorielle du destin cellulaire principalement par différenciation directe des SC, accompagnée de certains EdU + HC. Cependant, dans les cochlées non endommagées, avec knock-out MST1/2 par méthode transgénique, nous n'avons pas trouvé de prolifération cellulaire étendue, à l'exception d'un petit nombre de SC proliférés ou de HC surnuméraires immatures. Nous avons émis l'hypothèse que cette contradiction pourrait être due à la différence entre le micro-environnement endommagé par la néomycine et intact. Comme indiqué précédemment, les dommages pourraient déclencher certains mécanismes de régénération des HC, en particulier chez les espèces non mammifères telles que les oiseaux et les poissons50,51. En revanche, les HC de mammifères ne peuvent pas être régénérés spontanément. Dans la présente étude, nous concluons que Hippo-off via l'inhibition de MST1/2 ou la surexpression de Yap induit une accumulation nucléaire de YAP, en particulier dans les SC, ce qui induit un petit nombre de HC surnuméraires sans néomycine, ou le nombre de HC est augmenté avec la néomycine blessure in vitro. Nos résultats indiquent que dans l'état endommagé, la signalisation Hippo pourrait supprimer certaines barrières dans les SC pour les amener à se différencier directement en HC. Ce mécanisme doit être étudié plus en profondeur à l'avenir.

Structurellement, il existe des connexions neuronales entre les HC et les centres auditifs du cerveau. Dans le Mst1fl/fl/Mst2fl/fl ; Modèle de souris Sox9-CreERT2/+, nous avons constaté que les HC nouvellement générés étaient capables de favoriser la croissance des neurites. Fait important, la formation de fibres nerveuses a été observée in vivo, ce qui soutient l'hypothèse selon laquelle la génération de HC surnuméraires in situ attire les connexions entre les HC et les neurones, ce qui suggère que les nouveaux HC pourraient reconstruire les connexions neuronales et avoir ainsi le potentiel de restaurer la perte auditive. Cependant, la capacité de régénération des HC diminue rapidement avec l'âge in vivo et in vitro12,13. Les travaux futurs devraient donc se concentrer sur la compréhension des mécanismes sous-jacents à ces processus afin de développer de nouvelles stratégies de récupération de l'audition chez les mammifères.

Dans une étude précédente, il a été rapporté que la mécano-activation de YAP/TAZ favorise la souche épidermique par l'inhibition de la signalisation Notch52, et un grand nombre de travaux ont montré que les voies de signalisation Hippo, Wnt et Notch ne fonctionnent pas indépendamment et peuvent s'influencer mutuellement47,53,54,55. Il a également été rapporté que l'activation de la signalisation Wnt favorisait la prolifération de SC et que l'inhibition de la signalisation Notch stimulait la régénération de HC7,35. Ici, nous avons étudié l'influence de ces deux voies de signalisation classiques sur les fonctions d'Hippo dans la promotion de la régénération. La diaphonie entre la signalisation YAP et Notch influence le développement cellulaire, la différenciation cellulaire, les décisions du destin cellulaire, la morphogenèse, l'inflammation, les interactions stromales épithéliales et les oscillations géniques à grande échelle56. Il a été rapporté que YAP/TAZ active l'expression de Jagged-1 et favorise ainsi la différenciation des muscles lisses dépendant de Notch dans la crête neurale55. Dans notre étude, il n'y a pas eu d'augmentation évidente de la prolifération de SC ou de la régénération de HC dans le SR lors de la régulation combinée des voies Wnt et Hippo par rapport à la régulation d'Hippo seul. Cependant, il y avait une plus grande prolifération de SC et plus de régénération de HC dans le SR en réponse à la régulation combinée des voies Notch et Hippo par rapport à la régulation d'une seule voie de signalisation à la fois. Ces résultats suggèrent que l'inhibition de la voie Notch a un effet régulateur synergique et positif sur la signalisation Hippo, et nous poursuivrons nos recherches sur la régulation séquentielle de ces voies afin de vérifier directement ces hypothèses.

En conclusion, l'accumulation nucléaire de YAP en réponse à l'inhibition d'Hippo peut favoriser une légère prolifération de SC et peut induire une génération de HC surnuméraire chez les souris néonatales, et elle favorise en particulier la trans-différenciation directe de SC ainsi que des dommages à la néomycine principalement dans les tours apicaux à moyens de la cochlée. Nous fournissons de nombreuses preuves de l'effet positif de l'inhibition d'Hippo sur la régénération de HC et montrons l'effet synergique avec les voies de signalisation Notch et Wnt, ce qui, espérons-le, conduira à de nouvelles stratégies pour favoriser la prolifération de SC, la régénération de HC et la reconnexion avec les neurones de l'oreille interne des mammifères.

Toutes les souris transgéniques (Sup Tableau 1) ont été obtenues auprès du Jackson Laboratory. Pour l'activation de Cre, 15 µl de tamoxifène (Sigma) dissous dans de l'huile de maïs ont été injectés par voie intrapéritonéale à des souris P1–2 (40 mg/ml). Pour détecter les cellules en prolifération, 20 µl de l'analogue de la thymidine EdU (Kit d'imagerie Click-iT EdU ; Invitrogen) ont été injectés par voie intrapéritonéale à des souris néonatales P2-7 (5 mg/ml).

Nous nous sommes conformés à toutes les réglementations éthiques applicables aux tests et à la recherche sur les animaux. Toutes les expérimentations animales ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Fudan, et tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et pour prévenir leurs souffrances.

Des souris transgéniques ont été génotypées avec de l'ADN génomique extrait des extrémités de la queue à l'aide du système d'extraction d'ADN Viagen DirectPCR (Viagen). Les amorces de génotypage sont fournies dans le tableau supplémentaire 2.

L'ARN total a été extrait de la cochlée avec l'ébauche de la strie vasculaire, le modiolus et la membrane tectoriale retirés à l'aide de TRIzol (Ambion). La synthèse d'ADNc et les qPCR ont été réalisées avec le kit de synthèse d'ADNc PrimeScriptTM II 1st Strand (Takara) et TB GreenTM Premix Ex TaqTM II (Takara). Chaque PCR a été réalisée en triple exemplaire et la quantification relative de l'expression génique a été réalisée en utilisant la méthode ΔΔCT avec Gapdh comme référence endogène. Les paires d'amorces ont été conçues à l'aide du logiciel en ligne Primer3 et les séquences sont fournies dans le tableau supplémentaire 3.

Les cochlées de souris néonatales P2 ont été isolées dans des conditions stériles avec l'ébauche de la strie vasculaire, du modiolus et de la membrane tectoriale retirées avec une pince fine, puis placées sur des lamelles couvre-objets de 10 cm pré-enduites de Corning® Cell-Tak™ Cell and Tissue Adhesive. Des organes entiers ont été cultivés dans du milieu DMEM/F12 additionné de N2/B27 (Invitrogen) et d'une solution d'ampicilline sodique (Sangon Biotech) dans des boîtes de Pétri à quatre puits. Pour l'insulte HC, de la néomycine (1 mM, Sigma) a été ajoutée après une culture de 12 h, et 10 µM d'EdU ont été ajoutés pour détecter les cellules en prolifération. Dans le modèle de culture cochléaire in vitro, 1 mM et 5 mM XMU-MP-1 (Selleck), 5 µM DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophénacétyl)-L-alanyl]-S-phényl glycine t-butylester, un inhibiteur de la γ-sécrétase sécrétase), et 5 µM BIO (6-Bromoindirubine-3'-oxime) ont été ajoutés pour réguler l'activité biologique de la Wnt et Voies de signalisation Notch.

Pour construire les vecteurs adénoviraux recombinants de surexpression de Yap, le vecteur pAd/CMV/V5-DEST Gateway®, le vecteur pAd/PL-DEST Gateway® et 293 lignées cellulaires (Invitrogen, Carlsbad, Californie, États-Unis) ont été préparés. L'ADNc de souris pour Yap (NM_001171147CDS) a été inséré dans les vecteurs adénoviraux. Le vecteur digéré et les segments d'insert ont été ligaturés avec l'ADN ligase T4. Une extraction et un conditionnement approfondis des plasmides viraux ont été effectués, suivis d'une collecte et d'une amplification. Enfin, un adénovirus recombinant avec un titre de 1,2 × 1010 PFU/ml a été obtenu. Pour la transfection d'explants cochléaires, un adénovirus recombinant (Ad-null, Ad-GFP, Ad-YAP et Ad-YAP-GFP) a été ajouté au milieu et laissé incuber pendant 48 h. Les concentrations de virus recombinant étaient de 107, 108, 109, 3 x 109 et 1010 PFU/ml. Les tissus ont été préparés pour le marquage immunohistochimique et analysés 7 jours après l'incubation de l'adénovirus.

Les tissus ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,1 M pendant 10 min. Après trois lavages avec du PBS, les tissus ont été immergés dans une solution de blocage composée de 10 % de sérum d'âne et de 1 % de Triton-X100 dans du PBS à pH 7,4 pendant 1 h à température ambiante. Les anticorps primaires et les anticorps secondaires ont été dilués dans du Triton-X100 à 1 % dans du PBS pendant une nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée. Après lavage avec du PBS, les tissus ont été montés dans un milieu de montage à fluorescence antifade et recouverts d'une lamelle. Les principaux anticorps utilisés dans nos expériences étaient le lapin anti-Myosin7a (dilution 1:500) (Proteus Biosciences), la chèvre anti-Sox2 (dilution 1:500) (Abcam) et la souris anti-YAP (dilution 1:50) (Santa Cruz). Les faisceaux HC ont été marqués avec de la phalloïdine (dilution 1: 500) (Life Technologies), les fibres nerveuses ont été marquées avec Tuj1 (dilution 1: 500) (Abcam) et les noyaux ont été marqués avec DAPI (dilution 1: 500) (Sigma). L'expérience d'absorption FM1-43 a été réalisée en utilisant FM1-43FX, un analogue fixable de la coloration membranaire FM1-43 (dilution 1:500) (Invitrogen).

La cochlée a été perfusée immédiatement avec du paraformaldéhyde à 4 % après l'anesthésie de la souris. Les tissus ont ensuite été immergés dans du glutaraldéhyde à 2,5 % pour SEM. Les échantillons SEM ont été post-fixés dans du OsO4 tamponné au phosphate à 1 %, déshydratés dans une série d'éthanol gradué, séchés, montés sur une feuille d'aluminium et pulvérisés avec de l'or/palladium. Le SEM a été réalisé à l'aide d'un ZEISS GeminiSEM 300 (Allemagne). Les photos sont présentées en pseudo-couleur.

Évaluer les fonctions des HC natifs chez les souris WT et des HC nouvellement générés dans Mst1fl/fl/Mst2fl/fl ; Sox9-CreERT2/+ ; Souris Rosa26-tdTomato/+, nous avons effectué des enregistrements patch-clamp dans des organes excisés de Corti. Pour ces expériences électrophysiologiques, des cochlées de souris P7 WT ou de souris transgéniques ont été fraîchement disséquées dans du DMEM/F12 puis baignées dans une solution extracellulaire contenant (en mM) : 135 NaCl, 5,8 KCl, 1,3 CaCl2, 0,9 MgCl2, 0,7 NaH2PO4⋅H2O, 10 HEPES, 5,6 D-glucose, 2 Na-pyruvate (3 09 mOsm, le pH a été ajusté à 7,40 avec NaOH). Les tours apical et moyen des cochlées ont ensuite été immobilisés sur le verre avec du cell-TeK (Sigma) et transférés dans la chambre d'enregistrement. Des OHC natifs aléatoires, des SC proches des IHC et des HC régénérés dans le virage apical ont été sélectionnés pour l'enregistrement.

Des enregistrements patch-clamp de cellules entières ont été réalisés à l'aide du logiciel Patchmaster (HEKA Electronics) et de l'amplificateur EPC10/2 (HEKA Electronics, Lambrecht Pfalz, Allemagne). Les pipettes patch étaient de 3 à 5 MΩ extraites de capillaires en verre borosilicaté (Sutter). La solution de remplissage de la pipette contenait (en mM) : 112 K-méthane sulfonate, 20 KCl, 10 HEPES, 2 acide éthylène glycol tétraacétique, 10 Na-phosphocréatine, 3 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP (285 mOsm, le pH a été ajusté à 7,40 avec KOH). Les spécimens ont été observés dans un microscope droit (Olympus) avec une optique à contraste interférentiel différentiel Nomarski (objectifs à immersion dans l'eau 60 ×).

Les cellules ont été maintenues à -80 mV pour la pince de tension, et pour l'enregistrement du courant K+ total, nous avons utilisé des pas de tension de -120 mV à +50 mV à 10 mV par pas. Les expériences ont été réalisées à température ambiante et les tensions ont été corrigées hors ligne pour un potentiel de jonction liquide mesuré de 6 mV (K interne).

Les données d'électrophysiologie ont été analysées avec le logiciel Igor (Pro 6.22) et GraphPad Prism6. Pour l'analyse du courant K+, les données ont été acceptées si Rs n'était pas supérieur à 20 MΩ. Les données sont rapportées sous forme de moyennes ± SEM.

Six à huit cochlées cultivées ont été prélevées pour isoler l'ARN total à l'aide du kit AllPrep DNA/RNA/Protein Mini (QIAGEN) comme indiqué dans l'étude précédente32.

Le traitement préliminaire des lectures brutes a été effectué à l'aide de Casava 1.8 (Illumina), et les adaptateurs et les bases de mauvaise qualité ont été coupés à l'aide de trimmomatic (version 0.23). Les lectures coupées pour chaque échantillon ont été alignées sur le génome de Mus musculus UCSC mm10 à l'aide de Hisat250. Les lectures alignées ont été comptées avec HTseq (doi:10.1093/bioinformatics/btu638) selon l'annotation UCSC mm10. L'analyse de l'expression différentielle entre les conditions a été réalisée à l'aide du package DESeq2 R (Love et al., 2014). Les gènes avec une valeur p ajustée (padj) < 0,05 et un changement de facteur > 1,5 ont été considérés comme exprimés de manière différentielle. L'analyse de l'ontologie génétique des gènes exprimés de manière significativement différentielle a été effectuée avec DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp). Le package Pheatmap R a été utilisé pour générer des heatmaps. L'analyse du réseau d'interaction protéine-protéine (PPI) des gènes exprimés de manière différentielle dans les voies de signalisation Hippo, Notch et Wnt a été réalisée à l'aide du logiciel STRING.

Dans l'analyse d'enrichissement fonctionnel. Le seuil de 0,1 pour le taux de fausses découvertes a été utilisé pour inclure davantage de voies potentiellement impliquées.

La protéine totale de la cochlée a été isolée avec un tampon de lyse RIPA (Beyotime) additionné de PMSF (Beyotime). Les concentrations de protéines ont été mesurées à l'aide d'un kit de dosage de protéines BCA (Beyotime), et les protéines ont été séparées sur un gel BeyoGel ™ Plus Precast PAGE pour système Tris-Gly (Beyotime) et transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (Beyotime). Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé en poudre à 10 % dans une solution saline tamponnée au Tris avec du Tween 20 (TBST, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM de NaCl et 0,1 % de Tween 20) pendant 1 h à température ambiante, puis éponger pendant la nuit avec des anticorps primaires à 4 ° C. Les anticorps primaires étaient les suivants : lapin anti-Yap (dilution 1:1000) (CST), lapin anti-phospho-Yap (dilution 1:1000) (Ser127) (CST), lapin anti-LATS1 (dilution 1:1000) (CST), lapin anti-phospho-LATS1 (dilution 1:1000) (Thr1079) (CST), lapin anti-Cyr61 (dilution 1:500) (Santa Cruz) et anti-CTGF de chèvre (dilution 1:500) (Santa Cruz). Tous les blots dérivent de la même expérience et qu'ils ont été traités en parallèle.

Un microscope confocal SP8 a été utilisé pour acquérir des images fluorescentes. Toutes les images ont été étiquetées et traitées numériquement à l'aide d'ImageJ, Adobe Photoshop CS6 et Illustrator CC. Le schéma de principe a été réalisé à l'aide du logiciel CDR. Les comptages de cellules dans les images fluorescentes ont été effectués à l'aide d'ImageJ. Le nombre total de HC, de SC, de cellules EdU + et de cellules à double coloration a été compté dans des régions de 200 µm de la cochlée à partir des tours apical, moyen et basal.

Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel GraphPad Prism. Des tests t à un échantillon et des tests t de Student non appariés bilatéraux ont été utilisés pour déterminer la signification statistique lors de la comparaison de deux groupes, et une ANOVA unidirectionnelle et bidirectionnelle a été utilisée lors de la comparaison de plus de deux groupes. Une valeur de p < 0,05 était statistiquement significative. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Les données d'analyse de séquençage d'ARN ont été déposées dans le référentiel de la base de données publique GEO (numéro d'accès GSE213784).

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Ce travail a été soutenu par des subventions du National Key R&D Program of China (No. 2017YFA0103900), de la National Natural Science Foundation of China (Nos. 82192860, 81830029, 81900931, 81970879), de la National Natural Science Foundation of Shanghai (21ZR1411800), du Excellent Doctors-Excellent Clinical Researchers Program (Nos. SYB202008, SZA202002), le "Programme de voile" (19YF1406000) et les projets de recherche du Comité municipal de la santé de Shanghai (2020YJZX0110, 2022XD059).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Xiaoling Lu, Huiqian Yu, Jiaoyao Ma, Kunkun Wang.

ENT Institute and Department of Otorhinolaryngology, Eye & ENT Hospital, State Key Laboratory of Medical Neurobiology and MOE Frontiers Center for Brain Science, NHC Key Laboratory of Hearing Medicine (Fudan University), Fudan University, 200031, Shanghai, PR Chine

Xiaoling Lu, Huiqian Yu, Jiaoyao Ma, Kunkun Wang, Luo Guo, Yanping Zhang, Huawei Li et Shan Sun

École des sciences de la vie de l'Université de Xiamen, 361100, Xiamen, République populaire de Chine

Boan Li et Zehang Zhao

Instituts des sciences biomédicales, Université Fudan, 200032, Shanghai, République populaire de Chine

Huawei Li

The Institutes of Brain Science and the Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University, 200032, Shanghai, Chine

Huawei Li

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HL et SS ont conçu les études ; XL, HY, KW, JM et YZ ont mené les expériences ; XL, KW et HY ont acquis les données ; XL, HY, LG et SS ont analysé les données ; HL a fourni des réactifs ; et XL, HY et SS ont rédigé le manuscrit. XL, HY, JM et KW ont contribué à parts égales à ce travail.

Correspondance à Huiqian Yu, Huawei Li ou Shan Sun.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Lu , X. , Yu , H. , Ma , J. et al. La perte d'activité Mst1/2 favorise la génération de cellules ciliées non mitotiques dans l'organe néonatal de Corti. npj Regen Med 7, 64 (2022). https://doi.org/10.1038/s41536-022-00261-4

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Reçu : 17 janvier 2022

Accepté : 10 octobre 2022

Publié: 25 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41536-022-00261-4

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