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ROR2 s'autorégule

Oct 31, 2023Oct 31, 2023

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4449 (2022) Citer cet article

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Les follicules pileux subissent des cycles de régénération alimentés par les cellules souches du follicule pileux (HFSC). Alors que la signalisation Wnt canonique dépendante de la β-caténine a été largement étudiée et impliquée dans l'activation et la détermination du devenir des HFSC, on en sait très peu sur la fonction de la signalisation Wnt indépendante de la β-caténine dans les HFSC. Dans cette étude, nous étudions le rôle fonctionnel de ROR2, un récepteur Wnt, dans les HFSC. En analysant les HFSC appauvris en Ror2, nous découvrons que ROR2 est non seulement essentiel pour réguler la signalisation activée par Wnt qui est responsable de l'activation et de l'auto-renouvellement des HFSC, mais qu'il est également nécessaire pour maintenir une réponse appropriée aux dommages à l'ADN dépendant de l'ATM/ATR, ce qui est indispensable pour le maintien à long terme des HFSC. En analysant les HFSC dépourvus de β-caténine, nous identifions un rôle compensatoire de la signalisation ROR2-PKC dans la protection des HFSC β-caténine-null de la perte du pool de cellules souches. Collectivement, notre étude dévoile un rôle auparavant non reconnu de ROR2 dans la régulation de l'auto-renouvellement et de la maintenance des cellules souches.

Chez les mammifères, la signalisation Wnt fonctionne dans la morphogenèse tissulaire, l'activation des cellules souches et le développement tumoral1,2. La liaison des ligands Wnt sécrétés aux récepteurs et/ou co-récepteurs initie diverses cascades de signalisation qui peuvent être divisées en voies de signalisation Wnt canoniques dépendantes de la β-caténine et non-canoniques indépendantes de la β-caténine1. Ces voies pourraient agir indépendamment ou en coopération pour orchestrer diverses fonctions cellulaires.

La signalisation canonique Wnt (appelée signalisation Wnt/β-caténine) est activée lorsqu'un ligand Wnt se lie à Frizzled (Fzd) et LRP-5/6, ce qui déclenche l'activation des protéines Disheveled (Dvl), conduisant à l'inhibition du complexe de destruction, composé d'Axine, de caséine kinase 1α (CK1α), de polypose adénomateuse colique (APC) et de glycogène synthase kinase 3β (GSK3β), stabilisant ainsi la β-caténine3,4. La protéine β-caténine stabilisée est ensuite transloquée vers le noyau où elle se lie aux protéines du facteur d'amplification lymphoïde/facteur des cellules T (LEF/TCF) pour activer l'expression du gène cible5. Contrairement à la signalisation Wnt / β-caténine, les voies Wnt indépendantes de la β-caténine impliquent plusieurs cascades de signalisation intracellulaire qui pourraient être interconnectées. L'induction de la signalisation Wnt non canonique peut déclencher la libération de calcium intracellulaire, qui à son tour active les protéines kinases en aval, telles que la protéine kinase II dépendante du calcium/calmoduline (CaMKII) et la protéine kinase C (PKC)6,7,8. La signalisation Wnt non canonique peut également être transduite via la famille Rho des petites GTPases, qui activent la kinase N-terminale c-Jun (JNK) et le complexe activant la protéine-1 (AP-1) en aval pour la régulation transcriptionnelle, ou modulent directement l'organisation du cytosquelette qui orchestre la polarité cellulaire planaire (PCP) et la migration cellulaire9,10,11,12,13.

Le récepteur orphelin de type récepteur tyrosine kinase 2 (ROR2) a été initialement identifié avec ROR1 comme une tyrosine kinase de la famille Trk14, puis reconnu comme l'un des (co-)récepteurs Wnt en raison de sa capacité à interagir avec les Wnt non canoniques, y compris Wnt4, Wnt5a et Wnt1115,16. Des études génétiques montrent que les souris Ror2−/− présentaient des similitudes frappantes avec les souris Wnt5a−/−, suggérant qu'elles pourraient fonctionner dans la même voie de signalisation10,17. Chez les vertébrés, ROR2 est requis pour la migration cellulaire induite par Wnt5a, une fonction qui implique l'activation de JNK, PKC, de la protéine de liaison à l'actine Filamine A et de la famille Rho de la GTPase17,18,19,20,21. L'interaction de Wnt-ROR2 conduit à la phosphorylation de Dvl qui induit l'activation de AP-1 et Rac122,23. De plus, il a été démontré que ROR2 interagit avec et est phosphorylé par CK1 et GSK3, deux kinases qui jouent également un rôle impératif dans la signalisation Wnt/β-caténine20,24,25,26. Dans plusieurs systèmes, il a été démontré que Wnt5a inhibe la signalisation canonique Wnt médiée par la β-caténine27,28,29. La nature par laquelle ROR2 médie l'antagonisme dépendant de Wnt5a de la signalisation Wnt/β-caténine reste controversée. Dans certaines circonstances, Wnt5a inhibe la signalisation β-caténine induite par Wnt3a via ROR222,30,31,32,33 ; dans d'autres, ROR2 n'est pas requis pour cette inhibition10,26,34. En revanche, il a également été rapporté que ROR2 potentialise la signalisation Wnt/β-caténine. Dans les cellules d'ostéosarcome, ROR2 améliore la réponse transcriptionnelle à Wnt135 ; dans les cellules de carcinome pulmonaire, ROR2 active la signalisation canonique Wnt induite par Wnt3a en tant que co-récepteur avec Fzd231. La surexpression de ROR2 améliore la transcription médiée par la β-caténine ; à l'inverse, faire tomber ROR2 le diminue dans les cellules cancéreuses rénales36. Il convient de noter que les études qui ont analysé l'effet de ROR2 dans la signalisation Wnt/β-caténine ont principalement dépendu de la surexpression de la protéine et du dosage du rapporteur pour l'activité de signalisation Wnt/β-caténine. L'effet physiologique de ROR2 dans les activités de signalisation Wnt nécessite une enquête plus approfondie.

Toutes les cellules du corps sont exposées à des dommages à l'ADN causés par des facteurs exogènes, notamment des mutagènes, ou des processus endogènes, tels que le stress oxydatif. Ainsi, afin de maintenir l'intégrité génomique qui assure l'homéostasie des tissus et prévient le développement de maladies délétères telles que le cancer, la réparation de l'ADN médiée par la réponse aux dommages de l'ADN (DDR) est d'une importance vitale, en particulier pour les cellules souches adultes (SC) car elles persistent pendant de longues périodes dans les tissus adultes37,38. L'ataxie télangiectasie mutée (ATM) et liée à ATM et Rad3 (ATR) sont des kinases DDR qui sont principalement activées par des dommages génomiques ; cependant, les fonctions de l'ATM et de l'ATR dans les spécificités des dommages à l'ADN sont distinctes39,40. En réponse aux dommages à l'ADN, l'ATM et l'ATR sont activés et phosphorylent les protéines de signalisation en aval, telles que la kinase de point de contrôle 2 (CHK2) pour l'ATM et la kinase de point de contrôle 1 (CHK1) pour l'ATR, régulant ainsi les points de contrôle du cycle cellulaire, la réparation de l'ADN ou l'apoptose39,40,41. Indépendamment du DDR, l'ATM et l'ATR peuvent également être activés par la production excessive d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), qui pourrait être causée par un métabolisme oxydatif déséquilibré et/ou une accumulation de dommages à l'ADN non réparés42,43,44,45. En réponse aux ROS, l'ATM induit l'activation de la protéine kinase activée par l'AMP 5' (AMPK)43,46 et du facteur 2 lié au facteur nucléaire érythroïde 2 (NRF2)47,48 pour moduler le métabolisme oxydatif et induire une réponse antioxydante pour combattre les ROS, respectivement. Une déficience en DDR dépendant de l'ATM dans les SC peut entraîner une altération de l'auto-renouvellement ou de l'apoptose qui pourrait influencer le nombre de cellules souches et leur fonctionnalité49,50,51.

Le follicule pileux (HF) est un excellent système modèle pour étudier les mécanismes sous-jacents qui régulent l'activation et la maintenance des cellules souches52. Les HF matures progressent à travers des cycles de croissance (anagène), de dégénérescence (catagène), puis de repos (télogène)53,54. Les cellules souches du follicule pileux (HFSC), situées au niveau du renflement du HF au repos, restent au repos pendant la phase télogène du cycle pilaire. Au début de l'anagène, certains des HFSC deviennent prolifératifs et migrent vers le bas pour reconstituer le HF55 inférieur. L'activation des HFSC est étroitement régulée par des signaux microenvironnementaux provenant de leurs cellules de niche56,57,58,59,60,61. Au début de l'anagène, la signalisation Wnt/β-caténine régulée à la hausse dirige la régulation transcriptionnelle qui régit l'activation de HFSC62,63,64. Les HFSC dépourvus de β-caténine sont incapables de subir une régénération capillaire62,63,65, mais ils peuvent être maintenus dans leur niche d'origine sans perdre l'identité HFSC63. Cependant, on ne sait toujours pas quel est le mécanisme qui maintient le pool de HFSC β-caténine-null dans un milieu riche où les cellules voisines sécrètent diverses molécules de signal tout au long du cycle pilaire.

Dans cette étude, nous identifions un rôle surprenant pour ROR2 dans la régulation de l'auto-renouvellement et de la maintenance des cellules souches. À l'aide d'un modèle génétique de souris, nous avons montré que l'épuisement de Ror2 dans les HFSC provoquait un retard dans l'activation des HFSC, une régulation négative des gènes de souche HFSC et conduisait finalement à la perte d'une population de HFSC. En appauvrissant Ror2 dans les HFSC cultivés primaires, nous avons découvert que ROR2 est essentiel pour l'activation de la signalisation induite par Wnt et de la DDR dépendante de l'ATM/ATR, régulant ainsi la migration, la prolifération et la maintenance des HFSC. Enfin, en analysant les HFSC dépourvus de β-caténine, nous avons identifié la nécessité de ROR2 et de la PKC en aval pour protéger les HFSC β-caténine-nulles de la perte du pool de cellules souches et de la différenciation du mauvais sort. Ensemble, nos résultats révèlent que ROR2 non seulement régule la signalisation Wnt qui régit l'activation et la migration des HFSC, mais sert également de mécanisme de protection pour assurer la maintenance à long terme des HFSC.

Alors que les HFSC résident dans une niche exprimant des ligands Wnt tout au long du cycle pilaire66, on sait très peu de choses sur la fonction de signalisation Wnt dans les HFSC en dehors de la régulation dépendante de la β-caténine. Pour aborder cette question non résolue, nous nous sommes concentrés sur un récepteur Wnt, ROR2, qui est capable de transduire des signaux Wnt dépendants et indépendants de la β-caténine17,18,19,20,21,31,35. Nous avons d'abord examiné l'expression de ROR2 dans les HF en utilisant l'immunomarquage de la peau entière. Comme indiqué, ROR2 est assez bien exprimé dans les HFSC et les cellules voisines du renflement (Bu), mais relativement faible dans le germe pileux secondaire (HG) (Fig. 1a et Supplémentaire Fig. 1a). Notamment, l'expression de ROR2 dans le renflement est plus élevée dans les HF au début de l'anagène que dans le télogène (Fig. 1b supplémentaire). En purifiant les HFSC intégrine α6high / CD34 + des HF de souris au début télogène (appelé HFSC quiescent; qHFSC) et anagène (appelé HFSC activé; aHFSC) à l'aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), nous avons confirmé que le niveau de protéine ROR2 était élevé dans les aHFSC par rapport aux qHFSC (Fig. 1b et Supplémentaire Fig. 1c). Pour déterminer si le ROR2 régulé à la hausse est fonctionnellement significatif pour l'activation de HFSC, nous avons généré des souris K15CrePGR; Ror2fl / fl; ROSA26LSL-YFP en croisant une lignée de souris portant la recombinase Cre inductible pilotée par le promoteur K15 (K15CrePGR) avec les souris portant des allèles Ror2 conditionnels (Ror2fl / fl) et un journaliste YFP activé par Cre (ROSA26LSL-YFP), puis Ror appauvri 2 dans les HFSC et leurs descendants aux jours postnatals (P) 18 à 25 (Fig. 1c). Nous avons observé que l'expression de ROR2 était compromise dans les HFSC Ror2 knock-out conditionnels (Ror2 cKO) purifiés par FACS (Fig. 1d et Fig. 1d supplémentaire), ainsi que diminuée dans le renflement des HF Ror2 cKO tandis que ROR1 restait assez exprimé (Fig. 1e supplémentaire). En analysant la progression du cycle pilaire, nous avons constaté que les HF Ror2 cKO présentaient un retard dans l'entrée de l'anagène par rapport aux HF témoins (Ror2 Ctrl) (Fig. 1e). Le retard d'entrée en anagène a été détecté en continu dans le cycle pilaire suivant au début de l'anagène, comme en témoigne l'entrée retardée en anagène du Ror2 cKO HF et la récupération du pelage de l'animal Ror2 cKO (Fig. 1f supplémentaire). Pour déterminer si le retard de l'entrée de l'anagène dans les HF de Ror2 cKO était causé par un défaut d'activation du HFSC, nous avons administré 24 heures d'EdU à des souris au début de l'anagène. L'immunomarquage de la peau Ror2 Ctrl et cKO pour CD34 et EdU a montré une diminution significative des HFSC prolifératives EdU + dans le renflement YFP + des HF Ror2 cKO (Fig. 1f), ce qui suggère que les HFSC Ror2 cKO affichaient une prolifération cellulaire réduite.

a Coloration par immunofluorescence à montage entier des HF de souris au début de l'anagène et télogène pour ROR2 (rouge) et CD34 (vert). Bu, renflement ; HG, germe capillaire. b L'expression de ROR2 est régulée positivement dans les HFSC activés. Analyses par immunotransfert de HFSC purifiés par FACS à partir de peaux de dos de souris P55 (pour HFSC au repos; qHFSC) et P22-23 (pour HFSC activé; aHFSC) pour ROR2 et β-Actine. La quantification des niveaux de protéine ROR2 à partir d'expériences indépendantes est illustrée par le graphique ci-dessous. Les données ont été normalisées à la β-actine. Les valeurs ont été calculées en comparant à qHFSC et rapportées en moyenne ± sd ; n = 4 transferts de HFSC triés par FACS indépendants ; *p = 0,0117. c Diagramme schématique illustrant l'entrée retardée du cycle capillaire chez les souris Ror2 cKO par rapport à leurs compagnons de litière Ctrl. Les souris ont été traitées avec RU486 pour activer la recombinase Cre dans les HFSC à P18-25. Morphogénèse M, Tel télogène, Ana anagène, Chat catagène, M mâles, F femelles. d Analyses PCR en temps réel avec des HFSC Ror2 Ctrl et cKO purifiés par FACS depuis le début anagène (Ana) et le télogène tardif (Late Tel). Les valeurs ont été normalisées par rapport à l'ARNm de Ror2 Ctrl HFSC. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± sd ; n = 5 (Ana) ou 4 (Late Tel) animaux biologiquement indépendants ; **p < 0,005. e Coloration H & E des peaux de dos de souris Ror2 Ctrl et cKO aux jours postnatals (P) indiqués (en haut). Quantification du pourcentage de HF aux stades indiqués du cycle pilaire montrant un retard d'entrée en anagène des HF Ror2 cKO (en bas). f Les HFSC Ror2 cKO affichent un retard d'activation au début de l'anagène. Après 24 h de marquage EdU, les peaux de femmes P32 ont été immunocolorées (à gauche) et quantifiées (à droite). Mx, matrice. Les données sont rapportées sous forme de médiane (la ligne dans la boîte), les 25e à 75e centiles (lignes inférieure et supérieure de la boîte) et les 10e à 90e centiles (moustaches inférieures et supérieures) ; n = 7 (Ctrl) ou 4 (cKO) HF examinés sur une paire d'animaux ; **p = 0,0031. Toutes les valeurs p ont été calculées à l'aide d'un test t bilatéral non apparié. Les barres d'échelle dans a, e, f représentent 50 μm. Tous les résultats sont représentatifs d'au moins deux expériences indépendantes. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour vérifier davantage le rôle de ROR2 dans l'activation des HFSC, nous avons également analysé l'effet de l'épuisement de Ror2 dans les HFSC synchronisés et activés par l'épilation des cheveux à la 2e phase télogène (Fig. 2a supplémentaire). L'analyse histologique et les expériences de marquage EdU avec de la peau épilée Ror2 Ctrl et cKO ont montré un retard dans l'activation de HFSC induite par l'épilation et l'entrée d'anagène dans la peau Ror2 cKO (Fig. 2a et Fig. 2b supplémentaire), ce qui est conforme à ce que nous avons trouvé dans le cycle capillaire pendant l'homéostasie (Fig. 1e, f). Le défaut de prolifération des HFSC pourrait être récapitulé dans les HFSC purifiés par FACS à partir des HF Ror2 Ctrl et cKO au début de l'anagène. Plus précisément, lorsque les HFSC primaires ont été cultivées avec des cellules nourricières de fibroblastes dans le milieu qui favorise la prolifération des HFSC, les HFSC Ror2 cKO présentaient moins de nombres de colonies que les HFSC Ctrl (Fig. 2b), indiquant une capacité altérée des HFSC Ror2 cKO à proliférer. Étant donné que la signalisation Wnt / β-caténine est essentielle pour l'activation de HFSC et que ROR2 surexprimé est capable de transduire la signalisation canonique Wnt dans les cellules cultivées, l'activation retardée des HFSC Ror2 cKO pourrait être en partie causée par l'altération de l'activité de signalisation Wnt dépendante de la β-caténine. Pour aborder cette possibilité, nous avons examiné l'expression des gènes cibles Wnt / β-caténine dans les HFSC Ror2 Ctrl et cKO purifiés par FACS à partir de 3 jours de peau post-épilée (3dpd) en effectuant une analyse quantitative par PCR de transcription inverse (RT-qPCR). Comme le montre la figure 2c, l'expression de gènes qui répondent à la signalisation Wnt dépendante de la β-caténine était significativement régulée à la baisse dans les HFSC Ror2 cKO activés par l'épilation. Cette régulation à la baisse a également été détectée dans les HFSC Ror2 cKO au début de l'anagène pendant le cycle capillaire (Fig. 2d). Ces résultats suggèrent que l'activation de la signalisation Wnt/β-caténine qui facilite la prolifération des HFSC et la progression de l'anagène dépend de ROR2, et la réduction de l'activité de signalisation canonique Wnt lors de l'épuisement de Ror2 entraîne le retard de l'activation des HFSC.

a Les HFSC Ror2 cKO activés par l'épilation affichent un retard d'activation. Deux jours après l'épilation et 24 h après le marquage EdU, les peaux épilées ont été immunocolorées (à gauche) et quantifiées (à droite). Les données sont rapportées sous forme de médiane (la ligne dans la boîte), les 25e à 75e centiles (lignes inférieure et supérieure de la boîte) et les 10e à 90e centiles (moustaches inférieures et supérieures) ; n = 8 (Ctrl) ou 10 (cKO) HF examinés sur une paire d'animaux ; ***p < 0,0001. La barre d'échelle représente 50 μm. b Efficacité de formation de colonies (CFE) des HFSC Ror2 Ctrl et cKO à partir de peaux de dos à apparition anagène. Les colonies de HFSC purifiées par FACS sont colorées avec de la rhodamine B (à gauche). Quantification de la CFE (à droite). Le nombre de colonies dont la taille est ≥ 3 mm2 a été compté. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± sd ; n = 3 puits indépendants ; *p = 0,0269. Les résultats sont représentatifs d'au moins deux expériences indépendantes. c, d Analyse PCR en temps réel pour les gènes cibles Wnt/β-caténine avec des HFSC Ror2 Ctrl et cKO purifiés par FACS 3 jours après l'épilation (c) ou au début de l'anagène (d). Les valeurs ont été normalisées par rapport à l'ARNm de Ror2 Ctrl HFSC. e, f Analyse PCR en temps réel pour les gènes de souche HFSC avec Ror2 Ctrl et cKO HFSC purifiés par FACS 3 jours après l'épilation (e) ou à la fin du télogène (f). Les données en c–f sont rapportées en tant que moyenne ± sd ; n = 4 animaux biologiquement indépendants ; *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. g Analyse FACS pour les cellules YFP + dans la population HFSC intégrine α6high / CD34 + des HF Ror2 Ctrl et cKO avant l'épilation (à gauche) et 3 semaines après l'épilation (au milieu). Le diagramme en points (à droite) montre les pourcentages de YFP+ HFSC récupérés 3 semaines après l'épilation. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± SEM ; n = 4 animaux biologiquement indépendants ; *p = 0,0365. h Analyse FACS pour les cellules YFP + dans la population HFSC intégrine α6high / CD34 + de Ror2 Ctrl et cKO HF au 2e télogène. Le diagramme de points appariés montre des pourcentages réduits de HFSC YFP + dans les HF cKO Ror2 par rapport aux HF Ror2 Ctrl. n = 10 paires indépendantes de compagnons de portée ; ***p = 0,0003. Toutes les valeurs p ont été calculées à l'aide d'un test t bilatéral non apparié. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

En plus des gènes cibles Wnt / β-caténine, nous avons également constaté que les HFSC Ror2 cKO activés par l'épilation présentaient une régulation négative significative d'un large ensemble de gènes de souche HFSC par rapport à leurs HFSC Ctrl (Fig. 2e). La régulation à la baisse de ces gènes a également été trouvée dans les HFSC Ror2 cKO à la fin du 2e télogène lorsque les HFSC ont été préparés pour l'activation (Fig. 2f). Ces résultats nous ont amenés à postuler que ROR2 peut également être nécessaire pour le maintien du pool HFSC pendant la régénération HF. Pour tester cette hypothèse, nous avons épilé le pelage de souris, puis utilisé FACS pour mesurer le pourcentage de cellules YFP + dans la population intégrine α6high / CD34 + HFSC avant l'épilation et 3 semaines après l'épilation lorsque les HF nouvellement formés sont revenus au télogène. Comme le montre la figure 2g, les HFSC YFP + Ror2 Ctrl ont été entièrement maintenus dans la niche des cellules souches après la fin de la régénération HF, mais seulement environ 82% des HFSC YFP + ont été récupérés à partir du pool précédent de HFSC Ror2 cKO, ce qui suggère que certains HFSC Ror2 cKO ont été perdus pendant la régénération HF. Un phénomène similaire a été détecté dans les HFSC Ror2 cKO au cours du cycle capillaire. En examinant le pourcentage de cellules YFP + dans la population α6high / CD34 + HFSC des HF Ror2 Ctrl et cKO à la 2e phase télogène, nous avons découvert que les HF Ror2 cKO présentaient un pourcentage inférieur de cellules YFP + dans leurs pools HFSC que les HF Ror2 Ctrl appariés (Fig. 2h), indiquant que certains HFSC Ror2 cKO n'ont pas été récupérés après le cycle capillaire. Cependant, nous avons remarqué que si des HFSC Ror2 cKO pouvaient survivre à la première épilation, ils étaient capables de maintenir la régénération HF ultérieure lors d'une épilation répétitive (Fig. 3a supplémentaire). Cela pourrait expliquer pourquoi les HFSC YFP + Ror2 cKO pourraient être assez maintenues dans certains HF âgés (Fig. 3b supplémentaire). Ce résultat suggère que la perte de ROR2 pourrait être compensée par d'autres facteurs dans les HFSC Ror2 cKO récupérés.

Dans l'ensemble, nos résultats impliquent que ROR2 est nécessaire pour l'activation de HFSC via la régulation de l'activité de signalisation Wnt/β-caténine, ainsi que pour le maintien d'une population de HFSC in vivo.

Comme nous avons constaté que le pool de HFSC était réduit dans les HF Ror2 cKO pendant la régénération de HF, nous avons évalué la capacité de maintenance des HFSC en effectuant des tests de formation de colonies et suivis de la culture à long terme avec des HFSC purifiés par FACS de Ror2 Ctrl et des HF cKO à télogène. Nous avons constaté que les HFSC télogènes Ror2 cKO affichaient également un nombre réduit de colonies dans le milieu de culture favorisant la prolifération (Fig. 3a), indiquant un défaut de capacité d'auto-renouvellement. Lorsque des colonies HFSC uniques qui se sont développées sur une couche nourricière ont été sélectionnées et passées en série en culture, les HFSC Ror2 cKO n'ont pas pu être maintenues à long terme (Fig. 3b). De plus, lors du retrait des cellules nourricières, les HFSC Ror2 cKO ont perdu leur capacité à proliférer et ont affiché une morphologie différenciée (Fig. 3c). Ces HFSC Ror2 cKO de type différenciation ont non seulement exprimé la cycline D1 inférieure (codée par Ccnd1), correspondant à leur prolifération plus faible, mais ont également perdu l'expression des marqueurs HFSC, Cd34 et Krt15 (Fig. 3d), ce qui implique que ROR2 est essentiel pour maintenir l'identité HFSC. Pris ensemble, les résultats des HFSC purifiés en culture confirment nos études in vivo démontrant que ROR2 joue un rôle essentiel dans l'auto-renouvellement et le maintien des HFSC.

un CFE de Ror2 Ctrl et cKO HFSC provenant de peaux de dos en phase télogène. Les colonies de HFSC purifiées par FACS sont colorées avec de la rhodamine B (à gauche). Quantification de la CFE (à droite). Le nombre de colonies dont la taille est ≥ 3 mm2 a été compté. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± sd ; n = 3 puits indépendants ; **p = 0,0007. Les résultats sont représentatifs d'au moins deux expériences indépendantes. b Les HFSC Ror2 cKO ne pouvaient pas être passés et maintenus à long terme. Des colonies individuelles de Ror2 Ctrl ou cKO HFSC ont été isolées, cultivées et repiquées. L'appauvrissement en Ror2 a été vérifié pour les colonies individuelles. (À gauche) Les HFSC Ror2 Ctrl peuvent être passés et maintenus avec des chargeurs, comme en témoigne l'expression YFP, tandis que les HFSC YFP + Ror2 cKO se sont perdus lors du passage. Les lignes pointillées blanches indiquent le contour des colonies HFSC. La barre d'échelle représente 200 μm. (Droite) Graphique montrant que les HFSC Ror2 cKO ne pouvaient pas être maintenus à long terme en culture. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± sd ; n = 3 groupes, 6 colonies par groupe ont été examinées. c Les HFSC Ror2 cKO cultivées présentent une morphologie de type différenciation et une capacité de prolifération réduite. (À gauche) Images de contraste interférentiel différentiel (DIC) de HFSC Ror2 Ctrl et cKO cultivés à long terme. (À droite) Les capacités de prolifération des HFSC Ror2 Ctrl et cKO ont été mesurées sur la base des comptages quotidiens du nombre de cellules. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± sd ; n = 3 puits d'échantillons individuels. La barre d'échelle représente 50 μm. d Les HFSC Ror2 cKO cultivées montrent une expression réduite des marqueurs HFSC, Cd34 et Krt15. qPCR des ARNm (à gauche) et immunotransfert (à droite) des HFSC Ror2 Ctrl et cKO à passage supérieur. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± sd ; n = 3 colonies HFSC indépendantes ; Ror2, **p < 0,0001 ; Ccnd1, **p = 0,0001 ; Cd34, **p = 0,0075 ; Krt15, **p = 0,0028. Toutes les valeurs p ont été calculées à l'aide d'un test t bilatéral non apparié. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Comme les HFSC Ror2 cKO purifiés ne pouvaient pas être maintenus en culture, nous avons généré des HFSC Ror2 − / − en cultivant des HFSC portant des allèles Ror2 conditionnels (Ror2fl / fl) et un rapporteur YFP (ROSA26LSL − YFP), et en les transduisant avec une recombinase Cre lentivirale en culture (Fig. 4a supplémentaire). De cette façon, nous avons pu examiner les altérations de la transduction du signal et de l'expression génique dans les HFSC lors de la perte de Ror2. Nous avons d'abord confirmé l'efficacité de la déplétion de Ror2 dans les HFSC. Comme indiqué, l'expression de la protéine ROR2 a été complètement abolie dans les HFSC exprimant Cre (Ror2-/-) tandis que l'expression de ROR1 augmentait dans les HFSC Ror2-/- pendant le passage (panneau de gauche, Fig. 4a). Nous avons ensuite caractérisé les HFSC Ror2−/− en examinant leurs réponses à la stimulation Wnt. Des études antérieures ont montré que ROR2 médie la migration cellulaire induite par Wnt5a via l'activation de JNK, PKC et de petites GTPases17,18,19,20,21. Ici, nous avons examiné les HFSC témoins (Ror2+/+) et Ror2−/− pour l'activation induite par Wnt5a de JNK et PKC, ainsi que pour les activités de Rac1 et Cdc42. En effectuant une analyse Western Blot avec des HFSC stimulés par Wnt, nous avons montré que Dvl2 était phosphorylé (bandes supérieures décalées, pointe de flèche dans le panneau de gauche de la figure 4a) et que les protéines effectrices en aval JNK et PKC des sous-familles classiques et nouvelles (appelées PKC dans notre étude) étaient activées lors de la stimulation de Wnt5a dans les HFSC Ror2+/+, mais ces activités étaient atténuées dans les HFSC Ror2−/− (+Wnt5a , panneau de gauche, Fig. 4a). À l'aide d'un petit test d'activation GTPase établi qui utilise des protéines de fusion glutathion S-transférase (GST) reconnaissant les formes actives (formes liées au GTP) de Rac1 et Cdc42, nous avons constaté que, quelle que soit la stimulation de Wnt5a, les activités de Rac1 et Cdc42 étaient nettement réduites dans les HFSC Ror2 −/− (Fig. 4b). Il convient de noter que bien que ROR1 ait été régulé à la hausse dans les HFSC Ror2-/- en culture, cette régulation à la hausse était apparemment insuffisante pour compenser la régulation de la signalisation médiée par Wnt5a-ROR2. Ensemble, ces données démontrent le rôle essentiel de ROR2 dans la transduction de la signalisation dépendante de Wnt5a dans les HFSC.

a Les HFSC Ror2+/+ et Ror2−/− ont été traitées avec Wnt5a ou Wnt3a pendant 30 et 60 min avant d'être récoltées pour immunotransfert. La pointe de flèche désigne la forme phosphorylée de la protéine Dvl2. Les valeurs de changement de pli dans les taux de protéines sont indiquées sous les bandes indiquées. Les données ont été normalisées par rapport à la β-actine ou à l'α-tubuline et calculées en les comparant aux HFSC Ror2+/+ à 0'. La quantification des protéines phosphorylées en protéines totales dans le temps est présentée ci-dessous. b Les HFSC Ror2+/+ et Ror2−/− ont été traités avec Wnt5a pendant 2 h, et Rac1 ou Cdc42 lié au GTP ont été extraits et identifiés à l'aide d'un petit test d'activation de la GTPase. La quantification des taux de protéines est indiquée. Les données des protéines totales ont été normalisées à la β-actine. c ROR2 est requis pour l'activation transcriptionnelle de la signalisation canonique Wnt. Les HFSC ont été privés de nourriture pendant la nuit, puis traités avec Wnt3a pendant 6 h. Les plis d'induction de Wnt3a ont été calculés en comparant les HFSC traités par Wnt3a à leurs homologues traités par le véhicule. Des plis de réduction sont indiqués au-dessus des barres. Les données sont rapportées en moyenne ± sd d L'inhibition de l'activité GSK3β restaure l'expression des gènes cibles canoniques Wnt dans les HFSC Ror2-/-. Analyses PCR en temps réel des HFSC Ror2+/+ et Ror2−/− traités avec du DMSO (véhicule) ou du CHIR-99021 (GSK3i) pendant 24 h. e Les HFSC Ror2-/- ne répondent pas à la migration cellulaire induite par Wnt5a. Les capacités de migration des HFSC Ror2 + / + et Ror2 − / − ont été examinées par un test de migration cellulaire transwell avec Wnt5a ou du sérum comme chimioattractant. f Analyses PCR en temps réel des HFSC Ror2+/+ et Ror2−/− pour Ror2, Ror1, la tige HFSC et les gènes liés au destin HF. Notez qu'à l'exception de Nfatc1 qui est lié à l'état de repos des HFSC, les HFSC Ror2-/- ont exprimé des niveaux inférieurs de gènes liés à la souche HFSC et au destin HF. Les données en d–f sont rapportées en tant que moyenne ± sd ; n = 3 expériences indépendantes ; *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. Toutes les valeurs p ont été calculées à l'aide d'un test t bilatéral non apparié. Tous les résultats d'immunotransfert sont représentatifs d'au moins deux expériences indépendantes. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Non seulement Wnt5a, mais Wnt3a, un ligand Wnt canonique, pourrait également activer JNK dans les HFSC de manière indépendante de ROR2 (+ Wnt3a, panneau de gauche, Fig. 4a). Curieusement, l'épuisement de Ror2 pourrait compromettre de manière proéminente l'inactivation de GSK3β induite par Wnt3a et la dégradation d'Axin1 (+ Wnt3a, panneau de droite, Fig. 4a). Comme indiqué, la stimulation de Wnt3a et de Wnt5a pourrait induire l'inactivation de GSK3β, contrôlée par l'augmentation de la phosphorylation de Ser-9 ; cependant, cette inactivation a été supprimée dans les HFSC Ror2 − / − (panneau de droite, Fig. 4a). De manière frappante, la forme inactive globale de GSK3β était inférieure à celle des HFSC témoins (panneau de droite, Fig. 4a), tandis que la phosphorylation de GSK3β au niveau de Tyr-216 n'était pas modifiée (Fig. 4b supplémentaire). Puisque la GSK3β est considérée comme une kinase constitutivement active67,68, la réduction du niveau de sa forme inactive suggère l'élévation de l'activité de la kinase GSK3β. En effet, l'activité élevée de GSK3β dans les HFSC Ror2-/- a été confirmée par une augmentation de la p-β-caténine S33/37/T41 (panneau de droite, Fig. 4a). Une augmentation de p-LRP6S1490 est l'autre preuve d'une activité GSK3β élevée dans les HFSC Ror2 - / - (panneau de droite, figure 4a). Conformément à cette observation, nous avons également découvert que les HFSC Ror2 - / - présentaient une réduction significative de l'expression induite par Wnt3a des gènes cibles canoniques Wnt par rapport aux HFSC Ror2 + / + (Fig. 4c). L'inhibition de l'activité GSK3β par le traitement de CHIR-99021 (inhibiteur de GSK3 ; GSK3i) a augmenté le pool total de β-caténine (Fig. 4c supplémentaire) et restauré l'expression des gènes cibles canoniques Wnt dans les HFSC Ror2-/- (Fig. 4d), soulignant en outre que la régulation négative de la signalisation Wnt/β-caténine dans les HFSC Ror2-/- a été causée par unle activité GSK3β cendrée qui a amélioré la dégradation de la β-caténine. Ces résultats appuient notre découverte in vivo montrant que les gènes cibles Wnt / β-caténine étaient régulés à la baisse dans les HFSC Ror2 cKO activés (Fig. 2c, d) et suggèrent que la régulation à la baisse de la signalisation Wnt / β-caténine pourrait être l'une, mais pas la seule, cause de l'activation retardée des HFSC.

La réduction des activités JNK, PKC et des petites GTPases a suggéré que les HFSC Ror2-/- pourraient avoir des défauts dans la migration cellulaire induite par Wnt5a. Pour explorer cette possibilité, nous avons effectué un test de migration cellulaire transwell avec des HFSC Ror2+/+ et Ror2−/− en utilisant Wnt5a ou du sérum comme chimioattractant. Comme le montre la figure 4e, Wnt5a a favorisé de manière significative la migration cellulaire des HFSC Ror2 + / +, mais cet effet migratoire a été complètement aboli dans les HFSC Ror2 − / −. Même après stimulation avec du sérum, qui contient des stimuli de migration supplémentaires, les HFSC Ror2-/- étaient toujours incapables de migrer efficacement (Fig. 4e), ce qui suggère que les HFSC Ror2-/- sont défectueuses dans le mouvement cellulaire. En effet, lorsqu'ils ont été examinés par un test de migration des plaies par égratignure, les HFSC Ror2 − / − affichaient une capacité altérée dans la migration cellulaire collective (Fig. 4d supplémentaire), indiquant le rôle irremplaçable de ROR2 dans la régulation de la motilité des HFSC.

De plus, conformément à nos découvertes in vivo (Fig. 2e, f), nous avons également découvert que les HFSC Ror2 - / - cultivées étaient incapables de maintenir l'expression des gènes de souche HFSC. En fait, à l'exception de Nfatc1, qui est associé à la quiescence des HFSC, les HFSC Ror2 − / − exprimaient des niveaux inférieurs de gènes de souche HFSC ainsi que de gènes liés au destin de HF (Fig. 4f). Prises ensemble, nos analyses avec des HFSC cultivées dépourvues de Ror2 confirment non seulement les découvertes précédentes selon lesquelles ROR2 médie la signalisation et la migration cellulaire dépendantes de Wnt5 via l'activation de JNK, PKC et de petites GTPases, mais démontrent également que ROR2 endogène est nécessaire pour maintenir l'activation transcriptionnelle de la β-caténine canonique induite par Wnt via la régulation de la stabilité de GSK3β.

En plus des défauts de migration cellulaire, en menant des expériences de marquage EdU, nous avons également observé que moins de HFSC Ror2-/- subissaient une synthèse d'ADN en phase S, comme en témoigne un nombre réduit de HFSC Ror2-/- montrant l'incorporation d'EdU (Fig. 5a). Fait intéressant, l'analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux a montré une diminution de la proportion de Ror2-/- HFSC en phase G0/G1 et l'accumulation de Ror2-/- HFSC dans les phases S et G2/M (Fig. 5b). Les résultats du marquage EdU et de l'analyse du cycle cellulaire ont montré que les HFSC Ror2-/- présentaient une progression plus lente de la phase S et un arrêt du cycle cellulaire G2/M. Le ralentissement de la réplication de l'ADN est la marque du point de contrôle des dommages à l'ADN en phase S, et l'arrêt du cycle cellulaire G2/M est également une conséquence des dommages à l'ADN69,70 ; ainsi, nos résultats suggèrent que les HFSC Ror2-/- montaient une réponse aux dommages à l'ADN. Les dommages à l'ADN peuvent être déclenchés par des facteurs exogènes ou des sources endogènes. Compte tenu de l'égalité des conditions de culture des HFSC Ror2+/+ et Ror2−/−, les processus endogènes, tels que le stress oxydatif, étaient susceptibles d'être à l'origine des dommages à l'ADN dans les HFSC Ror2−/−. Pour aborder ces possibilités, nous avons effectué une immunocoloration pour γH2AX, un biomarqueur des cassures double brin de l'ADN (DSB)71, et de la 8-oxoguanine (8-oxoG), un biomarqueur pour mesurer l'effet des dommages oxydatifs de l'ADN72. Comme le montrent la Fig. 5c et la Fig. 5a supplémentaire, trois fois plus de HFSC Ror2−/− montrant plus de 6 foyers γH2AX que de HFSC Ror2+/+ ont indiqué l'accumulation de DSB d'ADN dans les HFSC Ror2−/−. Nous avons également trouvé un pourcentage significatif de HFSC Ror2 - / - affichant une coloration nucléaire de 8-oxoG, ce qui n'est pas détecté dans les noyaux des HFSC Ror2 + / + (Fig. 5d). La coloration nucléaire du 8-oxoG dans les HFSC Ror2−/− a suggéré une augmentation de la production de ROS intracellulaires. À en juger par la coloration avec le colorant CellROX, le niveau de ROS était en effet significativement plus élevé dans les HFSC Ror2 − / − (Fig. 5e). Ensemble, nos résultats impliquent que l'épuisement de Ror2 entraîne une production excessive de ROS et une accumulation de dommages à l'ADN, ce qui entraîne à son tour une prolifération lente et un arrêt du cycle cellulaire.

a Les HFSC Ror2-/- présentent une prolifération cellulaire réduite. Les HFSC ont été étiquetés avec EdU pendant 4 h avant l'examen. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± SEM ; n = 5 expériences indépendantes ; ***p = 0,00001. b L'appauvrissement en Ror2 entraîne une progression plus lente de la phase S et un arrêt du cycle cellulaire à la phase G2/M. (À gauche) Le contenu en ADN des HFSC a été coloré au DAPI et analysé par cytométrie en flux. (À droite) Le graphique à barres illustre la distribution du cycle cellulaire. c Les HFSC Ror2−/− montrent une augmentation significative des cassures double brin. Coloration par immunofluorescence des HFSC Ror2+/+ et Ror2−/− pour γH2AX (rouge). Les pointes de flèches indiquent les foyers γH2AX. La quantification des cellules montrant plus de 6 foyers est illustrée à droite. d Coloration par immunofluorescence des HFSC Ror2+/+ et Ror2−/− pour la kératine 5 (Krt5 ; vert) et la 8-oxoguanine (8-oxoG ; rouge). La quantification des cellules montrant le 8-oxoG nucléaire est illustrée à droite. e Analyse par cytométrie en flux du niveau de ROS dans les HFSC Ror2+/+ et Ror2−/− à l'aide du réactif CellROX Deep Red. Les valeurs de changement de pli au niveau ROS sont indiquées à droite. f–i Analyses par immunotransfert des HFSC Ror2+/+ et Ror2−/− pour les protéines activées et totales d'ATM et ATR (f), AMPK (h), NRF2 (i), ainsi que pour les substrats phosphorylés ATM/ATR et ROR2 (g). La vinculine, l'α-tubuline et la β-actine ont été utilisées comme contrôles internes pour les expériences indiquées. Les valeurs de changement de pli dans les taux de protéines sont indiquées sous les bandes indiquées. j L'inhibition de l'activité GSK3β restaure le niveau d'expression et l'activité de NRF2, mais pas d'AMPK, dans les HFSC Ror2-/-. Analyses par immunotransfert avec des HFSC Ror2+/+ et Ror2−/− traités avec du DMSO (véhicule) ou du CHIR-99021 (GSK3i) pendant 24 h. Les barres d'échelle en c et d représentent respectivement 15 et 50 μm. Les données en b–e sont rapportées en tant que moyenne ± sd ; n = 3 expériences indépendantes ; **p < 0,005, ***p < 0,0005 (b), **p = 0,0035 (c), **p = 0,0024 (d), *p = 0,02 (e). Toutes les valeurs p ont été calculées à l'aide d'un test t bilatéral non apparié. Tous les résultats d'immunotransfert sont représentatifs d'au moins deux expériences indépendantes. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

ATM et ATR sont des régulateurs centraux du DDR, et ATM fonctionne également comme un capteur redox pour contrôler le niveau de ROS. Le déficit en ATM augmente le niveau de ROS et réduit la réponse antioxydante dépendante de NRF237,42,43. La production excessive de ROS et l'accumulation de dommages à l'ADN dans les HFSC Ror2−/− nous ont conduit à postuler que l'épuisement de Ror2 pourrait altérer la DDR dépendante de l'ATM et/ou de l'ATR. Pour tester cette possibilité, nous avons examiné l'activité ATM, ainsi que l'activité de l'ATR, qui pourrait agir comme un régulateur complémentaire de l'ATM dans la DDR73. Les analyses par immunotransfert ont montré une réduction spectaculaire de l'activité et de l'expression protéique totale de l'ATM, et dans une moindre mesure de l'ATR, dans les HFSC Ror2 − / − (Fig. 5f). L'activité ATM/ATR réduite dans les HFSC Ror2-/- a été confirmée par la diminution des niveaux de phosphorylation des substrats ATM/ATR qui régulent les points de contrôle du cycle cellulaire et la réparation de l'ADN73 (Fig. 5g). Plus précisément, CHK2 et CHK1, les cibles directes en aval de l'ATM et de l'ATR, respectivement, ont été régulées à la baisse dans les HFSC Ror2 − / − (Fig. 5b supplémentaire).

En raison du niveau élevé de ROS, la régulation à la baisse de l'ATM dans les HFSC Ror2-/- pourrait également compromettre les effecteurs en aval ATM activés par ROS, AMPK et NRF2. En effet, la phosphorylation de l'AMPK et du NRF2 était toutes deux diminuée dans les HFSC Ror2 - / - par rapport à leurs cellules témoins (Fig. 5h, i). La régulation à la baisse de NRF2 a en outre été démontrée par la réduction remarquable de NRF2 activé dans le noyau des HFSC Ror2 − / − (Fig. 5c supplémentaire). Fait intéressant, il a été démontré que l'inhibition de NRF2 pouvait entraîner une répression transcriptionnelle des gènes ATM et ATR ; ainsi, une réduction spectaculaire de l'activité de NRF2 pourrait expliquer pourquoi les niveaux protéiques totaux d'ATM et d'ATR étaient largement compromis dans les HFSC Ror2-/-.

Il a également été démontré que GSK3β inhibe l'activité d'AMPK74 et régule la dégradation de NRF275 ; ainsi, l'activité GSK3β libérée dans les HFSC Ror2-/- pourrait être l'une des causes conduisant à leur régulation négative. En fait, l'inhibition de l'activité GSK3β par le traitement de l'inhibiteur de GSK3 pourrait restaurer le niveau d'expression et l'activité de NRF2 dans les HFSC Ror2-/- à des niveaux comparables à ceux des HFSC Ror2+/+, mais n'a eu aucun effet sur l'activité AMPK (Fig. 5j). Ces données suggèrent qu'une activité excessive de GSK3β résultant de la perte de ROR2 a partiellement contribué à une réponse oxydative déséquilibrée dans les HFSC Ror2-/-. En résumé, nos résultats révèlent un rôle précédemment non reconnu de ROR2 dans la régulation de la DDR dépendante de l'ATM/ATR dans les HFSC. Sans ROR2, les HFSC sont incapables de réparer correctement les dommages à l'ADN et d'équilibrer la production / le nettoyage des ROS attribués à des déficiences dans l'activation de l'ATM, de l'ATR et de leur signalisation en aval, ce qui conduit finalement à une croissance cellulaire lente, à une accumulation de dommages à l'ADN non réparés et à l'élévation de ROS (Fig. 5d supplémentaire).

Contrairement aux HFSC Ror2 cKO, les HFSC β-caténine nulles sont maintenues dans leur niche à long terme, malgré leur incapacité à être activées pendant le cycle HF63. Cependant, le mécanisme qui empêche l'appauvrissement en HFSC β-caténine-null du pool de cellules souches reste incertain. À l'aide d'une lignée de souris mutantes conditionnelles inductibles pour la β-caténine (K15CrePGR; Ctnnb1fl / fl; ROSA26LSL-YFP), nous avons appauvri la β-caténine dans les HFSC et leurs descendants à P18–25, et avons constaté que les HF de la β-caténine cKO (β-cat KO) affichaient un retard dans l'entrée de l'anagène au 1er cycle pilaire, puis restaient au 2ème télogène tout au long de la vie, comme en témoignent le retard et l'incapacité de la récupération du pelage, respectivement (Fig. 6a). Notamment, les HF cKO β-cat arrêtés ont conservé des compartiments de renflement intacts (Fig. 6a, en bas à droite), ce qui a également été constaté dans l'étude précédente où la β-caténine était épuisée dans les HFSC au 2e télogène63. Fait intéressant, lors de l'analyse de l'expression des gènes de souche HFSC dans les HFSC β-cat Ctrl et cKO à la 2e phase télogène, nous avons trouvé une association de niveaux d'expression inférieurs des gènes de souche HFSC avec la régulation à la hausse de l'expression de Ror2. Au début du télogène, les HFSC cKO β-cat présentaient des niveaux similaires ou légèrement élevés de gènes de souche HFSC ; dans ces HFSC, le niveau d'expression de l'ARNm de Ror2 était comparable à celui de leurs HFSC témoins (Fig. 6b, en haut). Cependant, dans les HFSC télogènes β-cat cKO tardifs où l'expression des gènes de souche HFSC a diminué, le niveau d'ARNm de Ror2 est devenu élevé (Fig. 6b, au milieu). L'élévation de l'expression de Ror2 a été conservée dans les HFSC β-cat cKO d'animaux âgés (Fig. 6b, en bas). En accord, l'expression élevée de Ror2 dans les HFSC cKO β-cat à la fin du télogène et les HF âgés a été confirmée par immunocoloration complète, montrant que l'expression de ROR2 était plus élevée dans le renflement des HF cKO β-cat que dans les HF Ctrl à la fin du 2e télogène (Fig. 6a supplémentaire) ainsi que chez les animaux âgés (Fig. 6b supplémentaire).

a β-cat cKO Les HF restent en phase télogène en permanence sans perdre le compartiment HFSC. (Haut) Diagramme schématique illustrant la progression du cycle capillaire des souris β-cat Ctrl et cKO. (En bas à gauche) La souris β-Cat cKO a affiché un retard dans la récupération du pelage au 1er anagène (P31), puis reste au 2e télogène en permanence sans entrer dans le prochain cycle capillaire, comme en témoigne l'absence de récupération du pelage de la peau rasée de l'animal plus âgé (P198). (En bas à droite) Coloration Oil Red O de sébocytes sur des peaux entières de souris β-cat Ctrl et cKO. Le compartiment renflé des HF cKO β-cat chez les animaux âgés est intact et les HFSC sont maintenus. b Analyses PCR en temps réel des HFSC β-cat Ctrl et cKO purifiés par FACS des HF télogènes précoces (P55-60), tardifs (P65-90) et âgés (> P250). Les valeurs des HFSC cKO β-cat ont été normalisées par rapport à l'ARNm HFSC β-cat Ctrl pour chaque ensemble. c L'appauvrissement en Ror2 dans les HF cKO β-cat entraîne la perte des HFSC et une différenciation erronée du destin. (Haut) Diagramme schématique illustrant la progression du cycle capillaire des souris Ror2/β-cat Ctrl, Ror2 cKO, β-cat cKO et Ror2/β-cat dKO. (En bas à gauche) Coloration Oil Red O de sébocytes sur des peaux entières de souris Ror2/β-cat Ctrl, Ror2 cKO, β-cat cKO et Ror2/β-cat dKO. (En bas à droite) La quantification des HF avec une structure normale, des glandes sébacées élargies (SG) ou accompagnées d'un renflement diminué est montrée. d Images d'immunofluorescence de peaux entières de souris Ror2 / β-cat Ctrl et dKO pour YFP. Les résultats sont représentatifs d'au moins trois expériences indépendantes. e Analyses PCR en temps réel des HFSC Ror2/β-cat Ctrl et dKO pour les gènes de souche HFSC. Les valeurs ont été normalisées par rapport à l'ARNm des HFSC Ror2/β-cat Ctrl. Les barres d'échelle dans a, c, d représentent 50 μm. Les données en b et e sont rapportées en tant que moyenne ± sd ; n = 4 (pour Early Tel), 5 (pour Late Tel) ou 3 (pour Aged Tel) animaux biologiquement indépendants (b), n = 4 animaux biologiquement indépendants (e); *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. Test t bilatéral non apparié. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour déterminer si ROR2 régulé à la hausse dans les HFSC β-cat cKO joue un rôle dans la maintenance des HFSC, nous avons généré une lignée de souris double mutante conditionnelle inductible pour Ror2 et β-caténine (K15CrePGR; Ror2fl / fl; Ctnnb1fl / fl; ROSA26LSL-YFP), appelée Ror2 / β-cat dKO. La déplétion de Ror2 et/ou de β-caténine a été initiée par l'administration de RU486 à des souris à P18-25. Semblables aux souris Ror2 cKO et β-cat cKO, les souris Ror2 / β-cat dKO ont également montré le retard de l'entrée en anagène au 1er cycle pilaire (Fig. 6c, en haut). Cependant, au début du 2e anagène, alors que les HF cKO Ror2 montraient en continu le retard d'entrée en anagène (Fig. 1e) et que les HF cKO β-cat étaient arrêtés au télogène (Fig. 6a et Fig. 7a supplémentaire), les HF dKO Ror2 / β-cat n'ont pas réussi à initier le cycle pilaire et ont montré des signes de différenciation massive des sébocytes (Fig. 6c et Fig. 7b supplémentaire). L'analyse quantitative des HF des souris Ctrl, Ror2 cKO, β-cat cKO et Ror2 / β-cat dKO a démontré que le phénotype affichant des glandes sébacées (SG) élargies n'était observé que chez les HF Ror2 / β-cat dKO et que plus de la moitié des HF Ror2 / β-cat dKO présentaient des SG élargis accompagnés d'une structure HF aberrante ou de compartiments renflés diminués (Fig. 6c, en bas). L'immunomarquage des HF à montage entier a révélé la perte progressive des HFSC CD34 + Ror2 / β-cat dKO ainsi que l'élargissement de SG (Fig. 7c supplémentaire). Le traçage de la lignée avec YFP a confirmé que ces sébocytes différenciés résidant dans des SG élargies ont été générés à partir de HFSC YFP + Ror2 / β-cat dKO activés par Cre (Fig. 6d). L'épuisement de Ror2 et de la β-caténine a été confirmé dans les HFSC YFP + Ror2 / β-cat dKO purifiés par FACS qui ont montré une régulation négative importante des gènes de souche HFSC (Fig. 6e); cette régulation à la baisse était encore plus significative que celle de Ror2 cKO (Fig. 2e, f) ou des HFSC télogènes tardifs β-cat cKO (Fig. 6b). En résumé, nos résultats dévoilent un rôle jusque-là non reconnu de ROR2 dans le maintien à long terme des HFSC, ce qui est particulièrement important pour les HFSC qui subiraient une différenciation erronée lors de l'activation.

Nous avons montré que ROR2 est nécessaire pour l'activation induite par Wnt de JNK et PKC (Fig. 4a). Sans stimulation supplémentaire de Wnt, les activités globales de JNK et PKC étaient déjà plus faibles dans les HFSC Ror2 − / − qui présentaient une réduction significative de p-GSK3βS9 dans le milieu de culture ordinaire (Fig. 8a supplémentaire). Outre les HFSC en culture, nous avons également constaté que les formes totales et activées des protéines JNK et PKC étaient significativement réduites dans les HFSC Ror2 cKO activés par l'épilation (Fig. 7a). L'immunomarquage de la peau entière Ror2 Ctrl et cKO au début de l'anagène a confirmé la réduction de l'expression des protéines JNK et PKC et de leurs activités dans les HFSC Ror2 cKO activés par l'épilation (Fig. 8b supplémentaire). Notamment, la réduction de l'expression de PKC dans les HFSC Ror2 cKO qui présentaient une expression réduite de ROR2 a persisté en phase télogène (Fig. 7b). Pour déterminer si les effets de l'épuisement de Ror2 dans la prolifération et le maintien des HFSC étaient causés par la régulation négative de JNK et/ou PKC dans les HFSC Ror2−/−, nous avons utilisé des inhibiteurs à petites molécules, SP600125 (inhibiteur de JNK ; JNKi) et GF109203X (inhibiteur de PKC sélectif des isoformes de PKC classiques et nouvelles ; PKCi), pour supprimer les activités de JNK et de PKC des HFSC en culture. , respectivement, puis ont examiné leurs effets sur la prolifération des HFSC en effectuant des expériences de marquage EdU. Comme indiqué, l'inhibition de PKC, mais pas de JNK, a effacé les différences de prolifération cellulaire entre les HFSC Ror2 + / + et Ror2 − / − (Fig. 8c supplémentaire), ce qui suggère que ROR2 régule la prolifération des HFSC, au moins en partie, via la signalisation dépendante de PKC.

a Analyses par immunotransfert de HFSC purifiés par FACS à partir de 3dpd Ror2 Ctrl et cKO HF. b Coloration par immunofluorescence complète du télogène tardif Ror2 Ctrl et cKO HF pour ROR2 (rouge) et PKCα (vert). Les analyses de quantification de l'intensité de fluorescence pour la coloration ROR2 et PKCα sont présentées à droite. Les données sont rapportées sous forme de médiane (la ligne dans la boîte), les 25e à 75e centiles (lignes inférieure et supérieure de la boîte) et les 10e à 90e centiles (moustaches inférieures et supérieures) ; n = 18 (Ctrl) ou 20 (cKO) régions sur 7 (Ctrl) ou 8 (cKO) HF indépendants ; ***p < 0,0001. Test t bilatéral non apparié. c Analyses par immunotransfert pour les protéines indiquées avec les HFSC Ror2+/+ et Ror2−/− qui ont été traités avec du DMSO (véhicule) ou du GF109203X (PKCi) pendant 24 h. d L'inhibition de la PKC dans les HF cKO β-cat entraîne la perte des HFSC et une différenciation erronée du destin. (Haut) Diagramme schématique illustrant la progression du cycle capillaire des souris Ror2/β-cat Ctrl, dKO et β-cat cKO traitées avec un inhibiteur de PKC à la 2e phase télogène. (En bas) La coloration Oil Red O des sébocytes sur des peaux entières post-traitées d'une semaine (à gauche) et la quantification des HF (à droite) sont illustrées. e Analyses PCR en temps réel de HFSC purifiées par FACS à partir de souris β-cat Ctrl ou cKO traitées à l'acétone (véhicule) ou au GF109203X (PKCi) pendant 24 h. Les valeurs des HFSC β-cat Ctrl et cKO traitées au GF109203X ont été normalisées par rapport à l'ARNm des HFSC β-cat Ctrl et cKO traités avec le véhicule, respectivement. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± sd ; n = 3 animaux biologiquement indépendants ; *p < 0,05, **p < 0,005. Test t bilatéral non apparié. f Un modèle illustratif résumant nos résultats dans cette étude. Dans les HFSC, ROR2 transduit non seulement la signalisation Wnt non canonique induite par Wnt5a via l'activation de PKC, JNK et de petites GTPases, mais module également la signalisation Wnt canonique induite par Wnt3a en contrôlant la stabilité de GSK3β. En parallèle, ROR2 joue également un rôle dans la régulation de la DDR dépendante de l'ATM/ATR. Ces régulations dépendantes de ROR2 modulent la prolifération cellulaire, la motilité et la réparation de l'ADN, qui sont essentielles pour le maintien à long terme des HFSC. Tous les résultats d'immunotransfert sont représentatifs d'au moins deux expériences indépendantes. Les barres d'échelle en b, d représentent 50 μm. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Il a été démontré que PKC phosphoryle et inactive GSK3β76,77, nous nous demandons si l'inhibition de PKC pourrait partiellement récapituler la perte de Ror2 en atténuant l'inactivation de GSK3β. Comme indiqué, l'inhibition de la PKC, validée par une réduction de l'activité de la PKC et du niveau de protéines totales lors du traitement par PKCi, a compromis l'inactivation de la GSK3β dans les HFSC Ror2 + / + à un niveau aussi bas que celui des HFSC Ror2 − / − (Fig. 7c), suggérant que la réduction de l'activité de la PKC lors de l'épuisement de Ror2 pourrait être l'une des causes conduisant à une activité élevée de la GSK3β. Fait intéressant, tout en augmentant la stabilité de la GSK3β, l'inhibition de la PKC n'a eu que des effets mineurs sur la stabilité de la β-caténine et l'activité transcriptionnelle dépendante de la β-caténine, jugées respectivement par les niveaux de phosphorylation / expression de la β-caténine et de l'expression canonique du gène cible Wnt (Fig. 7c et Fig. 9a supplémentaire). Ces données impliquent que la PKC module principalement le pool cytoplasmique de GSK3β dans les HFSC. De plus, en accord avec le fait que GSK3β module négativement l'activité de NRF2 dans les HFSC (Fig. 5j), l'inhibition de PKC, qui a stabilisé GSK3β, a entraîné une diminution de l'activité de NRF2 tout en ne montrant aucun effet significatif sur l'activation de l'AMPK (Fig. 9b supplémentaire). Pris ensemble, nos résultats impliquent qu'en plus de compromettre l'activation de la signalisation dépendante de Wnt, la perte de ROR2 a également entraîné une régulation négative de PKC, ce qui pourrait contribuer à la stabilisation de GSK3β et à l'inactivation de NRF2, entraînant ainsi une réponse oxydative déséquilibrée.

Nous avons montré que l'expression de ROR2 était élevée dans les HFSC β-cat cKO aux HF télogènes tardifs et âgés (Fig. 6 supplémentaire); Fait intéressant, nous avons également détecté une expression accrue de PKC dans ces HFSC β-cat cKO de HF télogènes tardifs (Fig. 10a supplémentaire) ainsi que chez des animaux âgés (Fig. 10b supplémentaire). Pour déterminer si la PKC joue un rôle en aval de ROR2 dans les HFSC β-cat cKO, nous avons inhibé l'activité de la PKC en appliquant PKCi sur la peau du dos des souris β-cat Ctrl et cKO pendant le 2e télogène (Fig. 7d, en haut). Notamment, 1 semaine après l'application de PKCi, les HFSC β-cat cKO avaient déjà subi une différenciation des sébocytes, et 3 semaines après le traitement, 77% des HF β-cat cKO avaient perdu leurs compartiments renflés accompagnés de SG élargis (Fig. 7d et Supplémentaire Fig. 10c). Le phénotype des HF cKO β-cat issus de l'inhibition de la PKC a récapitulé l'effet de l'épuisement de Ror2 dans les HFSC cKO β-cat, suggérant que PKC agit dans le même axe que ROR2 dans la régulation du maintien des HFSC. De plus, nous avons constaté que l'effet de l'inhibition de la PKC dans la régulation à la baisse des gènes de la souche HFSC était plus important dans les HFSC cKO β-cat que dans les HFSC β-cat Ctrl (Fig. 7e), ce qui suggère que la PKC dans les HFSC cKO β-cat joue un rôle en aval de ROR2 dans le maintien des HFSC. Ensemble, nos découvertes collectives fournissent des preuves convaincantes que la régulation dépendante de ROR2 est vitale pour la prolifération et le maintien des HFSC, en particulier lorsque les HFSC sont incapables de se différencier correctement.

Des recherches approfondies sur la façon dont la signalisation Wnt module le comportement des cellules souches se sont concentrées sur la voie Wnt canonique dépendante de la β-caténine, mais des informations très limitées sur la signalisation indépendante de la β-caténine dans la niche des cellules souches peuvent être trouvées. Cette lacune conceptuelle nous a incités à étudier la signification fonctionnelle d'un récepteur Wnt ROR2 dans la régulation des cellules souches en utilisant le HF comme système modèle. En utilisant un modèle génétique de souris, nous avons montré que ROR2 est indispensable pour l'auto-renouvellement et le maintien à long terme des HFSC. Des analyses plus poussées avec des HFSC en culture ont démontré que ROR2 transduit non seulement la signalisation Wnt non canonique activée par Wnt5a et la migration en activant PKC, JNK et de petites GTPases, mais est également nécessaire pour l'expression induite par Wnt3a des gènes cibles Wnt canoniques dans les HFSC via la régulation de la stabilité de GSK3β. De manière frappante, en recherchant la régulation dépendante de ROR2 responsable de la maintenance du HFSC, nous avons découvert une fonction auparavant non reconnue de ROR2 dans la régulation de la DDR dépendante de l'ATM/ATR, qui est importante pour le maintien de l'intégrité génomique du HFSC. Enfin, nos analyses avec des HFSC β-caténine-null ont en outre dévoilé un rôle compensatoire de la signalisation ROR2-PKC dans la protection des HFSC, en particulier pour ceux qui ne peuvent pas se différencier correctement, de la perte incontrôlable. Collectivement, nos résultats donnent un aperçu d'un réseau de signalisation régulé de manière croisée par un récepteur Wnt dans le contexte des cellules souches (Fig. 7f).

Plusieurs études ont soutenu l'idée que ROR2 médie l'antagonisme dépendant de Wnt5a de la signalisation Wnt/β-caténine22,30,31,32,33. Cependant, nos données indiquent que ROR2 n'est pas seulement responsable de l'activation de la signalisation dépendante de Wnt5a, mais est également essentielle pour la régulation transcriptionnelle canonique activée par Wnt dans les HFSC. Nous avons montré que les gènes cibles canoniques Wnt étaient régulés à la baisse dans les HFSC appauvris en Ror2 lors de l'activation des HFSC induite par l'épilation et au début de l'anagène, ces processus étant principalement régis par la signalisation Wnt/β-caténine pour favoriser l'entrée du cycle pilaire. Nous avons également constaté que l'épuisement de Ror2 diminuait l'activation transcriptionnelle induite par Wnt3a dans les HFSC en culture en raison de l'activité libérée de GSK3β. Les analyses in vivo et in vitro indiquent que ROR2 favorise l'activation plutôt que l'antagonisme de la signalisation Wnt/β-caténine dans les HFSC via la régulation de la stabilité de GSK3β. Nos résultats sont en accord avec ces études montrant que ROR2 surexprimé peut potentialiser l'activité de signalisation de la β-caténine induite par Wnt3a mesurée par le rapporteur de signalisation Wnt/β-caténine31,35,36. Pourtant, notre modèle de recherche offre un contexte physiologique permettant de déterminer l'action de ROR2 endogène dans la régulation de la signalisation Wnt/β-caténine.

Il a été démontré que les HFSC résident dans la niche riche en ligands Wnt non canoniques, par exemple Wnt4 et Wnt11, tout au long du cycle pilaire56,66,78, ce qui implique une possibilité d'activation de la signalisation Wnt non canonique dans les HFSC pour la maintenance. Dans notre étude, nous démontrons que ROR2 est essentiel pour activer la signalisation non canonique induite par Wnt dans les HFSC, et qu'une population de HFSC ne pourrait pas être maintenue sans ROR2. De plus, dans les HFSC β-cat cKO où la signalisation Wnt canonique est supprimée, ROR2 est régulé positivement pour protéger les HFSC β-caténine-null de la perte. Tous ces résultats soutiennent un modèle dans lequel la régulation dépendante de ROR2, au moins partiellement activée par des Wnt non canoniques, joue un rôle essentiel dans le maintien des HFSC à l'état de repos et/ou activé. En examinant les HFSC appauvris en Ror2 en culture, nous avons identifié une régulation dépendante de ROR2 dans la DDR médiée par ATM/ATR, qui est cruciale pour le maintien à long terme des HFSC. Cependant, il reste à savoir si ce mécanisme est utilisé par les HFSC résidant dans leur niche et si la régulation de la DDR par ROR2 dépend de Wnt. Ainsi, les recherches futures devraient se concentrer sur l'analyse de la dépendance de Wnt dans la régulation médiée par ROR2 et sur le déchiffrement du mécanisme de ROR2 sous-jacent à la régulation mentionnée ci-dessus, par exemple en identifiant les protéines interagissant avec ROR2.

Nos analyses avec le modèle de souris in vivo montrent que bien qu'une population de HFSC appauvris en Ror2 se soit perdue après le 1er cycle de régénération HF, les HFSC Ror2 cKO récupérés après le processus ont pu maintenir et reconstituer la lignée HF lors de la régénération suivante. Cependant, les HFSC Ror2 cKO purifiées par FACS n'ont pas pu être maintenues en culture à long terme dans le milieu favorisant la prolifération. Cet écart dans la survie des HFSC in vivo et en culture est probablement dû aux différences de fréquence de prolifération des HFSC. Les HFSC résidant dans leur niche d'origine sont maintenues dans un état de repos jusqu'au début du cycle pilaire. Même au début de l'anagène, seul un sous-ensemble de HFSC subit une prolifération pour l'auto-renouvellement et la régénération. Au contraire, les HFSC en culture sont constamment en prolifération, ce qui rend les HFSC vulnérables aux dommages à l'ADN. Compte tenu du déficit en HFSC appauvris en Ror2 dans la DDR dépendante de l'ATM/ATR, une fréquence élevée de réplication de l'ADN pourrait entraîner une accumulation rapide de dommages à l'ADN, ce qui entraînerait par la suite l'arrêt du cycle cellulaire ou la mort. Cela explique pourquoi les HFSC Ror2 cKO en culture présentaient des phénotypes plus forts que ceux résidant dans leur niche.

Notre identification sur le double rôle de ROR2 impliqué dans la signalisation Wnt canonique et non canonique a cristallisé l'idée que les cellules exploitent différents composants de signalisation Wnt pour construire un réseau de signalisation Wnt afin de maintenir la stabilité de l'état cellulaire. La capacité de ROR2 à transduire des signaux spécifiques à une condition implique probablement la disponibilité de co-récepteurs, de protéines en interaction ou d'effecteurs en aval. Par conséquent, la signalisation dépendante de ROR2 peut déclencher des effets spécifiques au type de cellule et conduire à un résultat fonctionnel dépendant de la situation. Cette dernière conjecture peut fournir la flexibilité requise au système pour accomplir de multiples fonctions. Les futures études devraient approfondir les interactions entre la signalisation Wnt canonique et non canonique dépendante de ROR2 qui contribuent à l'auto-renouvellement et à la maintenance des HFSC.

Les souris ont été hébergées et traitées selon les directives du Comité d'Ethique Animale Universitaire, Université Catholique de Louvain. Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément à la réglementation belge sur le bien-être animal. Toutes les souris de laboratoire sont hébergées dans des cycles lumière/obscurité 12:12 à température ambiante de 20 à 24 °C et dans des plages d'humidité de 45 à 65 %. Les souris K15CrePGR et Ror2fl/fl sur fond C57BL/6J ont été obtenues auprès du laboratoire Jackson. Des lignées de souris knock-out inductibles ont été générées en croisant K15CrePGR79, Ror2fl/fl et/ou Ctnnb1fl/fl,80, ROSA26LSL-YFP,81. La stratégie pour générer Ror2 cKO et leurs compagnons de portée témoins consistait à élever des mâles K15CrePGR+;Ror2+/fl;Rosa26LSL-YFP avec Ror2fl/fl; Femelles Rosa26LSL-YFP. Les animaux témoins pour les souris Ror2 cKO étaient des compagnons de litière Ror2 hétérozygotes (Cre +) de même sexe, ou des compagnons de portée de type sauvage (Cre-) uniquement lorsque les compagnons de portée des souris Ror2 cKO ne contenaient aucune souris hétérozygote Ror2. L'activité Cre-recombinase a été induite par injection intrapéritonéale de RU486 (1 mg/souris; TCI Europe NV) à P18, P21 et P24, et administration topique quotidienne de 4 % de RU486 dans de l'éthanol de P21 à P25. Pour induire une activation HFSC synchronisée, une épilation HF a été réalisée sur des souris anesthésiées à P55. Pour le traitement par inhibiteur de PKC, 100 μg de GF109203X (R&D Systems) dans de l'acétone (1 μg/μl) ou de l'acétone seule ont été appliqués sur la peau du dos de la souris P55 tous les deux jours pendant 3 jours. Les expériences ont été conçues sur la base de paires appariées selon le sexe, l'âge et la souche, principalement des membres de la même portée, et ont été répétées sur ≥ 3 paires d'ensembles d'échantillons. Le phénotype et les résultats obtenus étaient reproductibles chez les couples mâles et femelles.

Les procédures de purification FACS étaient telles que décrites précédemment63,78. En bref, la peau dorsale a été récoltée, mise au rebut pour éliminer les graisses et incubée dans de la trypsine à 0, 25% pendant 30 min (femelles) ou 40 min (mâles) à 37 ° C. Les cellules épidermiques et HF ont été éliminées et la suspension cellulaire a été filtrée à travers des tamis cellulaires de 70 et 40 μm (Fischer Scientific). Les cellules collectées ont été mises en suspension dans du PBS contenant 4% de FBS et incubées avec des anticorps avant FACS. Les cellules colorées ont ensuite été triées à l'aide d'un FACS Aria III (BD Biosciences) avec le logiciel FACS Diva v8.0.1. Fixable Viability Dye eFluor 780 a été utilisé pour exclure les cellules mortes. Les HFSC vivants ont ensuite été triés en fonction de l'expression de surface de l'intégrine α6, du CD34 et de la YFP cytosolique. Le schéma de déclenchement FACS est fourni dans la Fig. 11 supplémentaire. Les cellules ont été collectées soit dans un réactif TRI (Sigma-Aldrich) pour la purification de l'ARN, soit dans des tubes Flacon pré-enduits de 15 ml pour la purification des protéines, soit dans un milieu de culture avec des cellules nourricières pour la formation de colonies.

Des biopsies cutanées ont été prélevées et fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 ° C pendant 4 h, puis immergées dans du saccharose à 30 % à 4 ° C pendant la nuit avant d'être incorporées dans un composé OCT. Pour les montures entières de peau, la graisse de la peau du dos a été retirée, puis incubée dans une dispase à 2 mg / ml (Thermo Fisher Scientific) additionnée d'EDTA 20 mM à 4 ° C pendant la nuit. L'épiderme cutané avec les follicules pileux attachés a ensuite été décollé du derme et fixé dans du PFA à 4% pendant 30 min à température ambiante (RT). Les peaux entières lavées ont été stockées dans du PBS à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.

Pour l'immunofluorescence, des coupes de tissu de 7 µm ont été fixées, lavées et perméabilisées dans du Triton-X100 à 0,5 % pendant 20 min. Les coupes ont ensuite été incubées dans un tampon de blocage d'immunofluorescence (0,3 % Triton X-100, 1 % d'albumine de sérum bovin, 1 % de gélatine, 5 % de sérum de chèvre normal, 5 % de sérum d'âne normal dans du PBS) à température ambiante pendant 1 h, puis avec des anticorps primaires à 4 ° C pendant la nuit. Le cas échéant, le kit de fluorescéine MOM (Vector Laboratories) a été utilisé pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps monoclonaux primaires de souris. Les coupes de tissus ont été lavées et incubées avec un anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor (Jackson ImmunoResearch) à température ambiante pendant 1 h avant d'être montés avec un milieu de montage contenant du DAPI (Roth). Pour les tissus entiers, l'immunocoloration a été réalisée comme décrit précédemment avec une incubation d'une nuit des anticorps primaires à 4 ° C63. Les images de coloration par immunofluorescence ont été acquises à l'aide du logiciel Zen v3.0 (Zeiss) sur un microscope à fluorescence Axio Vert.A1 (Zeiss) ou du logiciel Zen v2.6 (Zeiss) sur un microscope confocal Axio observer Z1 (Zeiss). L'intensité de fluorescence a été mesurée à l'aide d'ImageJ.

Pour détecter la prolifération de HFSC in vivo, 1 mg d'EdU (5-éthynyl-2′-désoxyuridine; TCI Europe) par souris a été injecté par voie intrapéritonéale deux fois à 12 h d'intervalle pendant 24 h avant que des échantillons de peau ne soient prélevés. Pour le test de marquage EdU in vitro, les HFSC ont été cultivées sur des lames de chambre Nunc Lab-Tek II (Thermo Fisher Scientific) recouvertes de 10 μg / ml de fibronectine (Merck Millipore). Les cellules ont été incubées avec du DMSO (véhicule), 2 μM de SP600125 (JNKi) ou 0, 5 μM de GF109203X (PKCi) pendant 24 h, puis marquées avec 10 μM d'EdU pendant 4 h avant la détection. L'EdU incorporé a été détecté par un kit d'imagerie Click-iT EdU Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific) sur la base des instructions du fabricant.

Pour les essais de formation de colonies, des HFSC purifiés par FACS ont été ensemencés à 20 000 cellules/puits (pour les HF d'apparition anagène) ou 33 000 cellules/puits (pour les HF en phase télogène) d'une plaque à six puits contenant des nourrisseurs de fibroblastes de souris J2 3T3 traités à la mitomycine C (aimable cadeau du laboratoire E. Fuchs avec l'accord du laboratoire H. Green). Après deux semaines de co-culture, les colonies ont ensuite été fixées avec 4 % de paraformaldéhyde et colorées avec 1 % de rhodamine B. Le nombre de colonies dont la taille est ≥ 3 mm2 a été compté pour analyse. Pour les expériences de passage à long terme, trois groupes indépendants de 6 colonies par groupe ont été prélevés avec des cylindres clones (Bel-Art) et passés sur des nourrisseurs de fibroblastes traités à la mitomycine C dans une plaque à 24 puits. Les HFSC ont été trypsinisés et passés à une dilution de 1:10 sur des mangeoires tous les 10 jours pendant 10 passages. L'expression de Ror2 de chaque colonie a été validée par RT-qPCR.

Les HFSC purifiées par FACS de la peau du dos de souris Ror2fl/fl/ROSA26LSL-YFP ont été cultivées et développées sur des nourrisseurs de fibroblastes traités à la mitomycine C dans un milieu contenant 0,3 mM de calcium comme décrit82. Après 10 passages, les HFSC ont été retirés des mangeoires et prêts pour l'infection lentivirale. Pour le traitement des Wnts, les HFSC ont été privés de milieu contenant 0,5 % de FBS pendant 16 h, puis traités avec un véhicule (PBS), sans support 100 ng/ml Wnt3a (R&D Systems) ou 300 ng/ml Wnt5a (R&D Systems) pendant 30 ou 60 min avant la récolte pour la purification des protéines, ou pendant 6 h pour la purification de l'ARNm. Pour le traitement de l'inhibiteur de GSK3 ou de PKC, les HFSC ont été traités avec un véhicule (DMSO) ou 1 µM de CHIR99021 (R&D Systems) ou 1 µM de GF109203X (R&D Systems) pendant 24 h avant la récolte pour l'extraction des protéines.

Pour le test de migration cellulaire directionnelle, le test de migration cellulaire colorimétrique QCM 24 puits (Merck) a été effectué conformément au protocole du fabricant. Pour analyser la capacité de migration cellulaire collective, un test de migration des plaies par égratignure a été effectué. En bref, les HFSC sans alimentation ont été cultivées pour se développer en une monocouche confluente, puis la monocouche HFSC dans le milieu contenant 1 % de FBS avec ou sans 8 µg/ml de mitomycine C (Merck) a été grattée en ligne droite à l'aide d'une pointe de pipette pour créer un espace. Les images de la fermeture de l'écart ont été acquises à l'aide d'un microscope à contraste de phase à 0, 8 et 24 h après le grattage, et les écarts à chaque instant ont été mesurés à l'aide d'ImageJ. Les données présentées sont les moyennes de trois expériences indépendantes.

Pour l'analyse du cycle cellulaire, l'ADN des HFSC a été coloré avec 10 µg/ml de DAPI à 37 °C pendant 1 h, et la teneur en ADN a été mesurée par le cytomètre en flux LSR Fortessa avec le logiciel FACS Diva v8.0.1 (BD Biosciences) et analysée à l'aide du logiciel FlowJo v10.7.2. Pour mesurer le niveau de ROS intracellulaire, les HFSC ont été colorées avec le réactif CellROX Deep Red (Thermo Fisher Scientific) et analysées par le cytomètre en flux LSR Fortessa conformément aux instructions du fabricant.

Les cellules HEK293FT (Thermo Fisher Scientific) ont été transfectées au CaCl2 avec un mélange de plasmides contenant le plasmide d'expression lentivirale pLKO.1, les plasmides d'emballage viral PAX2 et MD2. 48 h après la transfection, le surnageant contenant le virus des cellules HEK293FT transfectées a été collecté, filtré et mélangé avec du polybrène (Sigma-Aldrich) et 10 % de FBS supplémentaires avant de l'appliquer aux HFSC Ror2fl/fl/ROSA26LSL-YFP. L'infection virale a été réalisée par centrifugation des HFSC avec un mélange contenant le virus à 1100 × g à 35 ° C pendant 1 h. 5 jours après l'infection, les HFSC ont été purifiées par FACS sur la base de l'expression RFP et/ou YFP. Les plasmides d'expression lentivirale suivants ont été utilisés : pLKO.1-NLS-iCre-mRFP (cadeau aimable de S. Beronja)83, pLKO.1-MCS-mRFP (dérivé de pLKO.1-NLS-iCre-mRFP où NLS-iCre a été remplacé par plusieurs sites de clonage).

Les ARN totaux provenant de cellules triées par FACS ou de cellules cultivées ont été purifiés avec le kit Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research) et transcrits avec le kit de synthèse d'ADNc ProtoScript(r) II First Strand (New England Biolabs). Les ADNc ont été amplifiés avec les amorces indiquées dans le test de PCR quantitative SYBR Green (Bio-Rad) sur le système de PCR en temps réel Thermoblock 96 Silver Block (Bio-Rad) et les numéros de cycle ont été enregistrés par le logiciel CFX Manager v3.1. Les niveaux d'expression relatifs ont été normalisés à l'amplification par PCR du gène domestique Ppib2 ou Rps16. Les amorces utilisées pour l'expression de l'ARNm sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 1. Les barres d'erreur pour les analyses qPCR ont été calculées à partir des réplicats biologiques indépendants (n ≥ 3) indiqués dans chaque ensemble de données.

Les HFSC ont été affamés puis traités avec 300 ng/ml de Wnt5a pendant 2 h avant la récolte pour un petit test d'activation de la GTPase. Pour le petit test d'activation de la GTPase, le kit combiné de test d'activation Rac1/Cdc42 (Cell Biolabs) a été réalisé conformément au protocole du fabricant. Pour l'analyse par immunotransfert, les protéines ont été extraites des cellules avec du tampon RIPA (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1% de NP-40, 0,5% de NaDeoxycholate, 0,1% de SDS, 1 mM EDTA, inhibiteur de protéase, inhibiteurs de phosphatase). Les lysats de protéines ont ensuite été chargés dans un gel Bis-Tris 4–12% (Thermo Fisher Scientific) et transférés sur une membrane de nitrocellulose (Thermo Fisher Scientific). Les membranes transférées ont été bloquées avec 5 % de BSA dans du tampon TBST à température ambiante pendant 1 h, puis incubées avec des anticorps primaires à 4 °C pendant la nuit. Après incubation, les blots ont été lavés puis incubés avec les anticorps secondaires conjugués à la HRP (Jackson ImmunoResearch) pendant 1 h. Les transferts ont été développés à l'aide d'un réactif de détection de chimioluminescence (substrats SuperSignal West, Thermo Fisher Scientific), et les signaux ont ensuite été détectés à l'aide du système d'imagerie Fusion SL (Vilber) avec le logiciel Fusion-Capt Advance Solo 4S v16.16b.

Les anticorps suivants (Abs) ont été utilisés pour le FACS : colorant de viabilité F780 (1:200, 65-0865), intégrine α6 (1:500, PE-conjugué, clone GoH3, 12-0495) et CD34 (1:100, Alexa Fluor 660-conjugué, clone RAM34, 50-0341) d'eBiosciences. Les anticorps suivants ont été utilisés pour l'immunotransfert : ROR2 (Ror2) de Developmental Studies Hybridoma Bank ; ROR1 (clone D6T8C, 16540), p-JNKT183/Y185 (clone 81E11, 4668), JNK (clone 56G8, 9258), p-PKCS660 (9371), PKCα (2056), Dvl2 (clone 30D2, 3224), p-LRP6S1490 (25 68), LRP6 (clone C5C7, 2560), p-GSK3βS9 (9336), GSK3β (clone 27C10, 9315), p-β-caténineS33/37/T41 (9561), Axin1 (clone C76H11, 2087), CK1 (2655), p-ATMS1981 (clone D6H9 , 5883), ATM (clone D2E2, 2873), p-ATRS428 (2853), ATR (2790), p-CHK2T68 (2661), CHK2 (2662), p-CHK1S345 (clone 133D3, 2348), CHK1 (clone 2G1D5, 2360), p-AMPKT172 (clone 4 0H9, 2535), AMPKα (2532), α-tubuline (2144), Lamin B1 (clone D9V6H, 13435), Vinculine (clone E1E9V, 13901) et substrats p-ATM/ATR (2851) de Cell Signaling Technology ; p-NRF2S40 (clone EP1809Y, ab76026) et NRF2 (ab137550) d'Abcam ; β-caténine (clone 15B8, C7207) et β-actine (clone AC-74, A2228) de Sigma-Aldrich ; CD34 (clone RAM34, 13-0341) de eBiosciences ; Rac1 (clone 23A8, 05-389), Cdc42 (07-1466) et GAPDH (clone 6C5, MAB374) de Merck-Millipore ; Krt5 (905901) et Krt15 (833901) de Biolegend ; p-GSK3βY216 (clone 13A, 612313) de BD Biosciences ; Anticorps secondaires conjugués à la HRP (715-035-150, 711-035-152, 712-035-150) de Jackson ImmunoResearch. Tous les anticorps primaires utilisés pour l'immunotransfert étaient à une dilution de 1:1000 et des anticorps secondaires à 1:4000. Les anticorps suivants ont été utilisés pour l'immunocoloration : ROR2 (1:100, Ror2) de Developmental Studies Hybridoma Bank ; ROR1 (1:100, 16540), p-JNKT183/Y185 (1:100, 4668), JNK (1:100, 9258), p-PKCS660 (1:100, 9371), PKCα (1:100, 2056), γH2AX (1:200, BET A300-081A- M) de la technologie de signalisation cellulaire ; GFP (1:1000, ab13970) d'Abcam ; β-caténine (1:100, C7207) de Sigma-Aldrich ; CD34 (1:100, 13-0341) de eBiosciences ; 8-oxoG (1:100, clone 483.15, MAB3560) de Merck-Millipore. Anticorps secondaires conjugués à un colorant fluorescent (703-545-155, 715-545-150, 715-585-150, 711-545-152, 711-585-152, 712-545-150, 712-585-150) de Jackson ImmunoResearch.

Des expérimentations animales ont été réalisées en nombre égal de souris mâles et femelles. Les phénotypes sont représentatifs d'un minimum de trois compagnons de portée appariés par le sexe (n ≥ 3). Les expériences n'étaient pas randomisées et les investigateurs n'étaient pas en aveugle lors de la collecte des données. Tous les résultats de RT-qPCR sont générés à partir d'au moins trois animaux biologiques indépendants ou d'expériences indépendantes. Tous les résultats de l'analyse histologique, de l'immunotransfert et de la coloration par immunofluorescence sont représentatifs d'au moins deux expériences indépendantes. Les graphiques ont été présentés à l'aide de GraphPad Prism 8. Les diagrammes à moustaches en boîte sont présentés comme la médiane (la ligne dans la boîte), les 25e à 75e centiles (lignes inférieure et supérieure de la boîte) et les 10e à 90e centiles (moustaches inférieure et supérieure). Les diagrammes de points ont été présentés comme la moyenne ± SEM. D'autres données ont été rapportées en tant que moyenne ± sd ; * p < 0,05, ** p < 0,005, *** p < 0,0005, ou valeurs p spécifiées dans les légendes des figures. Les analyses statistiques ont été déterminées par le test t de Student bilatéral non apparié pour toutes les expériences.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données à l'appui de cette étude sont incluses dans le fichier Source Data fourni avec cet article. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions Nicolas Dauguet pour le tri FACS (installation FACS à l'Institut de Duve) ; Slobodan Beronja, Valeri Vasioukhin, Frederic Lemaigre et Christophe Pierreux pour les discussions et les commentaires. AV et CMRL sont soutenus par des bourses FRIA (1.E136.15 à AV et 1.E041.16 à CMRL) du Fonds de la Recherche Scientifique (FNRS) et des bourses Patrimoine de l'Université catholique de Louvain (UCLouvain). GC est boursier FSR de l'UCLouvain et aspirant boursier (1.A551.19) du FNRS. CKC est soutenu par la Fondation Contre le Cancer et la bourse postdoctorale FSR de l'UCLouvain. W.-HL est chercheur indépendant du FNRS. Ce travail a été soutenu par des subventions (à W.-HL) du FNRS (Ulysse-F.6002.14 et PDR-T.0078.16), du Fonds Joseph Maisin (2016-2018) et de la Fondation Contre le Cancer (FAF-F/2016/792).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Anthony Veltri, Christopher MR Lang.

de Duve Institute, Université catholique de Louvain, 1200, Brussels, Belgium

Anthony Veltri, Christopher MR Lang, Gaia Cangiotti, Chim Kei Chan et Wen-Hui Lien

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AV et W.-HL ont conçu l'étude et conçu les expériences. AV a réalisé la majorité des expériences, analysé les données et préparé les chiffres. CL a développé des tests d'infection lentivirale et effectué des expériences critiques lors de la révision ; GC a effectué une partie des analyses histologiques, de la culture cellulaire et des expériences de RT-qPCR ; CKC a réalisé une partie des expériences FACS, de l'immunotransfert, de l'analyse du cycle cellulaire et de la mesure des ROS ; W.-HL a supervisé l'étude, effectué des expériences de culture cellulaire, analysé des données, préparé des figures et rédigé l'article. Tous les auteurs ont fourni une contribution intellectuelle et ont approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Wen-Hui Lien.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Mingxing Lei, Daniela Ungureanu et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Veltri, A., Lang, CMR, Cangiotti, G. et al. ROR2 régule l'auto-renouvellement et le maintien des cellules souches du follicule pileux. Nat Commun 13, 4449 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32239-7

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Reçu : 26 juin 2019

Accepté : 21 juillet 2022

Publié: 01 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32239-7

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